GB∕T 34756-2017
基本信息
标准号： GB∕T 34756-2017
中文名称：猪轮状病毒病 病毒RT-PCR检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB∕T 34756-2017 猪轮状病毒病 病毒RT-PCR检测方法
GB∕T34756-2017
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T34756—2017
猪轮状病毒病
病毒RT-PCR检测方法
Porcine rotavirus diseaseRT-PCR for detecting virus acid2017-11-01发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-05-01实施
中华人民共和国
国家标准
病毒RT-PCR检测方法此内容来自标准下载网
猪轮状病毒病
GB/T34756—2017
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址：spc.org.cn
服务热线：400-168-0010
2017年11月第一版
书号：1550661-57537
版权专有
侵权必究
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAT/TC181)）归口。GB/T34756—2017
本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、河南牧业经济学院本标准起草人：养薪瑗、邵卫星、魏荣、崔文、唐丽杰、季一经、姜艳平，孙映雪、季卫华、徐耀辉1
1范围
猪轮状病毒病
病毒RT-PCR检测方法
本标准规定了猪轮状病毒RT-PCR检测方法的试剂、仪器设备、操作程序。GB/T34756—2017
本标准适用于猪临床样品（新鲜粪便和小肠）及细胞培养物中猪轮状病毒核酸的检测。缩略语
下列缩略语适用于本文件
AMV：鸟类RNA病毒反转录酶（avianmyeloblastosisvirus）bp：碱基对（basepair）
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered salinebuffer）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RRI:RNA酶抑制剂(RNaseribonucleaseinhibitor）RT：反转录（reversetranscriptase）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptase-polymerasechainreaction）Tag酶：TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase）3试剂
除另有规定外，所用试剂应为分析纯。提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器进行分装。
3.1氯仿：常温保存
异丙醇。
75%乙醇。
二乙基焦磷酰胺（DEPC)。
Taq酶。
DNA分子量标准（DL2000bp）。
电泳缓冲液（TAE)（配制见A.1）。1.5%琼脂糖（配制见A.3）
猪轮状病毒阳性样品及阴性样品（见附录B）。4仪器设备
高速冷冻离心机。
GB/T34756—2017
PCR扩增仪。
核酸电泳系统。
恒温水浴锅。
冰箱（2℃~8℃、20℃）。
凝胶成像系统（或紫外透射仪）。组织匀浆器或研钵。
二级生物安全柜
微量加样器（0.5μ~10μ；2μ~20μ：20μ~200μ：100μ~1000μ）5操作程序
样品的采集、运输和处理
5.1.1样品采集和运输
采集腹泻急性期的小肠（5.0cm～10.0cm）或新鲜粪便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于带有冰袋的保存箱中，送至实验室。样品被运到实验室时，附带的冰袋应未完全融化：如样品不能被及时送到实验室，应置于一20℃冰箱中保存，贮存要求不超过1个月；如需长期保存样品，应置于一80℃冰箱。5.1.2样品处理
5.1.2.1小肠样品
取5.0cm~10.0cm小肠组织，用剪刀剪碎，加人10mLPBS.用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入RNA酶抑制剂RRI(40U/μL)500μL，一20℃反复冻融3次后，摇匀，取1.0mL到1.5mL离心管中，经12000r/min离心5min，取500μL上清备用5.1.2.2粪便样品
取0.5g～1.0g新鲜粪便，加人到含5.0mL～10.0mL样品处理液（配方见A.2）的玻璃瓶中，每毫升样品加人RNA酶抑制剂RRI(40U/μL)500μL，-20℃反复冻融3次后，摇勾，取1.0mL到1.5mL离心管中，经12000r/min离心5min，取500uL上清液备用。5.1.2.3细胞培养物样品
取细胞培养物，每毫升样品加入RNA酶抑制剂RRI（40U/uL）500uL，反复冻融3次，经2000r/min离心10min，取1mL上清备用。5.2RNA的提取
可选择市售商品化试剂盒，全自动核酸提取法或其他商品化提取法提取RNA。在提取RNA过程中设立阳性和阴性对照样品，RNA提取操作应在生物安全柜内进行。5.3反转录
5.3.1反转录引物序列
反转录引物采用下游引物P2，见附录C。5.3.2反转录反应体系
反转录的反应体系见附录D。
5.3.3反转录反应程序
GB/T34756—2017
42℃水浴1h.70℃灭活15min，结束反应。可以直接进行PCR，或者放于一20℃保存备用。试验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照。5.4PCR
5.4.1PCR引物序列
见附录C。
5.4.2PCR反应体系
见附录D。
5.4.3PCR反应程序
95℃预变性5min后进人PCR循环，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃终延伸10min，结束反应。1.5%琼脂糖电泳分析结果。5.5电泳
5.5.1制备1.5%琼脂糖凝胶板，见A.3。5.5.2取10.0μLPCR产物与2.0μLDNA上样缓冲液（6X）混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时加人DNA分子量标准作对照。
5.5.3盖好电泳仪，插好电极，电压为80V~100V，时间为30min。5.5.4用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档。5.5.5用分子量标准比较判断PCR片段大小。5.6
结果判定
5.6.1试验成立的条件
阳性对照的PCR扩增产物电泳后在271bp位置出现特异性条带，同时阴性对照和空白对照PCR扩增产物电泳后没有任何条带（参见图E.1），则试验结果成立；否则结果不成立。5.6.2阳性判定
在阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果都成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在271bp位置上出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核酸阳性。猪轮状病毒VP6基因扩增条带测序序列参见E.2。
5.6.3阴性判定
在试验结果成立的前提下，如果检测样品在271bp位置未出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核酸阴性。
GB/T34756—2017
电泳缓冲液的配制
附录A
（规范性附录）
溶液的配制
50XTAE的配制：准确称量242g三羟甲基氨基甲烷.57.1mL的冰乙酸、100mL0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0），加人蒸馏水至1L，室温放置备用。使用时，用蒸馏水稀释成1倍使用。样品处理液的配制
准确称量下列试剂，加去离子水定容至200mL，121℃灭菌20min后室温放置备用。氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
乙二胺四乙酸二钠
1.5%琼脂糖的配制
准确称取1.5g琼脂糖，加人100mL1×TAE，在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，取出，加入适量的染料，混匀，倒人制胶板中。4
阳性样品制备
附录B
（规范性附录）
猪轮状病毒阳性样品和阴性样品GB/T34756—2017
取猪轮状病毒细胞毒灭活后，用100mLPBS稀释至1个半数组织培养感染量TCIDso向其中加人不含猪轮状病毒的猪粪便10g，摇匀，分装，0.5mL/管，备用阴性样品制备
用PBS按10：1的比例稀释不含猪轮状病毒的猪粪便，摇勾，分装，0.5mL/管，备用。5
GB/T34756—2017
附录C
（规范性附录）
检测猪轮状病毒RT-PCR方法的引物序列、浓度及扩增片段引物序列及浓度见表C.1。
引物序列
引物名称
上游引物P1
下游引物P2
引物浓度
10pmol/μL
10pmol/μL
引物序列
5-GAAACGGAATAGCTCCACAAT-3
5\-GAATAATCAAATCCAGCCACC-3\说明
扩增片段为轮状病毒的VP6基
因，大小为271bp
D.1RT反应体系组成
10mmol/LdNTPs
RNA酶抑制剂
5×反应缓冲液
AMV反转录酶
下游引物P2(见附录C)
DEPC水
总体积
PCR反应体系
反转录产物（cDNA）
附录D
（规范性附录）
检测方法的RT和PCR反应体系
TaqDNA聚合酶反应缓冲液（10X）10 mmol/L dNTPs
上游引物P1(见附录C)
下游引物P2（见附录C)
TaqDNA聚合酶
灭菌去离子水
总体积
GB/T34756—2017
GB/T34756—2017
附录E
（资料性附录）
检测阳性样品电泳例图及核苷酸序列E.1检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例见图E.1。M
2000bp
1000bp
说明：
DNA分子量标准（2000bpDNALadderMarker）；阳性对照；
阴性对照；
粪便样品。
图E.1猪轮状病毒阳性检测样品的核酸电泳结果E.2
猪轮状病毒VP6基因第317～587位核昔酸序列TGAAATGGCTAGAGAGTCGCAACGAAACGGAATAGCTCCACAATCTGAAGCACTGAGAAAGCTGTCAGGTATTAAGTTTAAGGGAATTAATTTTGACAATTCATCTGATTACATTGAGAATTGGAATTTACAAAATAGACGACAGCGTACTGGATTCGTGTTCCATAAGCCAAATATACTTCCATACTCAGCATCATTCACTTTGAATAGATCACAGCCGGCACATGATAATTTAATGGGGACTATGTGGATTAACGCTGGATCAGAAATT(271bp）版权专有侵权必究
GB/T34756-2017
书号：155066·1-57537
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猪轮状病毒病
病毒RT-PCR检测方法
Porcine rotavirus diseaseRT-PCR for detecting virus acid2017-11-01发布
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2018-05-01实施
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猪轮状病毒病
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2017年11月第一版
书号：1550661-57537
版权专有
侵权必究
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAT/TC181)）归口。GB/T34756—2017
本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、河南牧业经济学院本标准起草人：养薪瑗、邵卫星、魏荣、崔文、唐丽杰、季一经、姜艳平，孙映雪、季卫华、徐耀辉1
1范围
猪轮状病毒病
病毒RT-PCR检测方法
本标准规定了猪轮状病毒RT-PCR检测方法的试剂、仪器设备、操作程序。GB/T34756—2017
本标准适用于猪临床样品（新鲜粪便和小肠）及细胞培养物中猪轮状病毒核酸的检测。缩略语
下列缩略语适用于本文件
AMV：鸟类RNA病毒反转录酶（avianmyeloblastosisvirus）bp：碱基对（basepair）
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered salinebuffer）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RRI:RNA酶抑制剂(RNaseribonucleaseinhibitor）RT：反转录（reversetranscriptase）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptase-polymerasechainreaction）Tag酶：TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase）3试剂
除另有规定外，所用试剂应为分析纯。提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器进行分装。
3.1氯仿：常温保存
异丙醇。
75%乙醇。
二乙基焦磷酰胺（DEPC)。
Taq酶。
DNA分子量标准（DL2000bp）。
电泳缓冲液（TAE)（配制见A.1）。1.5%琼脂糖（配制见A.3）
猪轮状病毒阳性样品及阴性样品（见附录B）。4仪器设备
高速冷冻离心机。
GB/T34756—2017
PCR扩增仪。
核酸电泳系统。
恒温水浴锅。
冰箱（2℃~8℃、20℃）。
凝胶成像系统（或紫外透射仪）。组织匀浆器或研钵。
二级生物安全柜
微量加样器（0.5μ~10μ；2μ~20μ：20μ~200μ：100μ~1000μ）5操作程序
样品的采集、运输和处理
5.1.1样品采集和运输
采集腹泻急性期的小肠（5.0cm～10.0cm）或新鲜粪便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于带有冰袋的保存箱中，送至实验室。样品被运到实验室时，附带的冰袋应未完全融化：如样品不能被及时送到实验室，应置于一20℃冰箱中保存，贮存要求不超过1个月；如需长期保存样品，应置于一80℃冰箱。5.1.2样品处理
5.1.2.1小肠样品
取5.0cm~10.0cm小肠组织，用剪刀剪碎，加人10mLPBS.用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入RNA酶抑制剂RRI(40U/μL)500μL，一20℃反复冻融3次后，摇匀，取1.0mL到1.5mL离心管中，经12000r/min离心5min，取500μL上清备用5.1.2.2粪便样品
取0.5g～1.0g新鲜粪便，加人到含5.0mL～10.0mL样品处理液（配方见A.2）的玻璃瓶中，每毫升样品加人RNA酶抑制剂RRI(40U/μL)500μL，-20℃反复冻融3次后，摇勾，取1.0mL到1.5mL离心管中，经12000r/min离心5min，取500uL上清液备用。5.1.2.3细胞培养物样品
取细胞培养物，每毫升样品加入RNA酶抑制剂RRI（40U/uL）500uL，反复冻融3次，经2000r/min离心10min，取1mL上清备用。5.2RNA的提取
可选择市售商品化试剂盒，全自动核酸提取法或其他商品化提取法提取RNA。在提取RNA过程中设立阳性和阴性对照样品，RNA提取操作应在生物安全柜内进行。5.3反转录
5.3.1反转录引物序列
反转录引物采用下游引物P2，见附录C。5.3.2反转录反应体系
反转录的反应体系见附录D。
5.3.3反转录反应程序
GB/T34756—2017
42℃水浴1h.70℃灭活15min，结束反应。可以直接进行PCR，或者放于一20℃保存备用。试验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照。5.4PCR
5.4.1PCR引物序列
见附录C。
5.4.2PCR反应体系
见附录D。
5.4.3PCR反应程序
95℃预变性5min后进人PCR循环，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃终延伸10min，结束反应。1.5%琼脂糖电泳分析结果。5.5电泳
5.5.1制备1.5%琼脂糖凝胶板，见A.3。5.5.2取10.0μLPCR产物与2.0μLDNA上样缓冲液（6X）混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时加人DNA分子量标准作对照。
5.5.3盖好电泳仪，插好电极，电压为80V~100V，时间为30min。5.5.4用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档。5.5.5用分子量标准比较判断PCR片段大小。5.6
结果判定
5.6.1试验成立的条件
阳性对照的PCR扩增产物电泳后在271bp位置出现特异性条带，同时阴性对照和空白对照PCR扩增产物电泳后没有任何条带（参见图E.1），则试验结果成立；否则结果不成立。5.6.2阳性判定
在阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果都成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在271bp位置上出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核酸阳性。猪轮状病毒VP6基因扩增条带测序序列参见E.2。
5.6.3阴性判定
在试验结果成立的前提下，如果检测样品在271bp位置未出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核酸阴性。
GB/T34756—2017
电泳缓冲液的配制
附录A
（规范性附录）
溶液的配制
50XTAE的配制：准确称量242g三羟甲基氨基甲烷.57.1mL的冰乙酸、100mL0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0），加人蒸馏水至1L，室温放置备用。使用时，用蒸馏水稀释成1倍使用。样品处理液的配制
准确称量下列试剂，加去离子水定容至200mL，121℃灭菌20min后室温放置备用。氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
乙二胺四乙酸二钠
1.5%琼脂糖的配制
准确称取1.5g琼脂糖，加人100mL1×TAE，在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，取出，加入适量的染料，混匀，倒人制胶板中。4
阳性样品制备
附录B
（规范性附录）
猪轮状病毒阳性样品和阴性样品GB/T34756—2017
取猪轮状病毒细胞毒灭活后，用100mLPBS稀释至1个半数组织培养感染量TCIDso向其中加人不含猪轮状病毒的猪粪便10g，摇匀，分装，0.5mL/管，备用阴性样品制备
用PBS按10：1的比例稀释不含猪轮状病毒的猪粪便，摇勾，分装，0.5mL/管，备用。5
GB/T34756—2017
附录C
（规范性附录）
检测猪轮状病毒RT-PCR方法的引物序列、浓度及扩增片段引物序列及浓度见表C.1。
引物序列
引物名称
上游引物P1
下游引物P2
引物浓度
10pmol/μL
10pmol/μL
引物序列
5-GAAACGGAATAGCTCCACAAT-3
5\-GAATAATCAAATCCAGCCACC-3\说明
扩增片段为轮状病毒的VP6基
因，大小为271bp
D.1RT反应体系组成
10mmol/LdNTPs
RNA酶抑制剂
5×反应缓冲液
AMV反转录酶
下游引物P2(见附录C)
DEPC水
总体积
PCR反应体系
反转录产物（cDNA）
附录D
（规范性附录）
检测方法的RT和PCR反应体系
TaqDNA聚合酶反应缓冲液（10X）10 mmol/L dNTPs
上游引物P1(见附录C)
下游引物P2（见附录C)
TaqDNA聚合酶
灭菌去离子水
总体积
GB/T34756—2017
GB/T34756—2017
附录E
（资料性附录）
检测阳性样品电泳例图及核苷酸序列E.1检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例见图E.1。M
2000bp
1000bp
说明：
DNA分子量标准（2000bpDNALadderMarker）；阳性对照；
阴性对照；
粪便样品。
图E.1猪轮状病毒阳性检测样品的核酸电泳结果E.2
猪轮状病毒VP6基因第317～587位核昔酸序列TGAAATGGCTAGAGAGTCGCAACGAAACGGAATAGCTCCACAATCTGAAGCACTGAGAAAGCTGTCAGGTATTAAGTTTAAGGGAATTAATTTTGACAATTCATCTGATTACATTGAGAATTGGAATTTACAAAATAGACGACAGCGTACTGGATTCGTGTTCCATAAGCCAAATATACTTCCATACTCAGCATCATTCACTTTGAATAGATCACAGCCGGCACATGATAATTTAATGGGGACTATGTGGATTAACGCTGGATCAGAAATT(271bp）版权专有侵权必究
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