HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法 Water quality—Identification of mutagenicity—Vicia faba root-tip micronucleus test ( HJ 1016-2019 2019-09-01实施) 1 适用范围 本标准规定了鉴别水样致突变性的蚕豆根尖微核试验法。 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的致突变佳鉴别 2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准 GB/T6920水质pH值的测定玻璃电极法 HJ/T91地表水和污水监测技术规范 HJ/T164地下水环境监测技术规 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 微核 micronuclei 真核细胞中，游离于主核之外的小核即为他核，其物构成和特性与主核一致，大小般为主核13以下，是染色体变的一种表现形式

中华人民共和国国家环境保护标准HJ1016-2019
致突变性的鉴别
蚕豆根尖微核试验法
WaterqualityIdentificationofmutagenicityViciafabaroot-tipmicronucleustest（发布稿）
本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2019-04-13发布
2019-09-01实施
生态环境部发布
1适用范围
2规范性引用文件
3术语和定义.
4方法原理...
5试剂和材料..
6仪器和设备..
7受试生物.
8受试生物准备
9样品
10分析步骤.
11结果计算与表示
12精密度.
13质量保证和质量控制
14废物处理.
附录A
附录B
附录C
附录D
附录E
附录F
（资料性附录）
有丝分裂各期细胞、根尖细胞微核计数区及微核判定参考图片....9（资料性附录）松滋青皮豆特性及保种（资料性附录）根尖处理皿参考图片（规范性附录）试样急性毒性预试验（资料性附录）Kruskal-Wallis检验方法（资料性附录）原始记录表和试验报告表12
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水样致突变性的鉴别方法，制定本标准。本标准规定了鉴别地表水、地下水、生活污水和工业废水中致突变性的蚕豆根尖微核试验法。
本标准的附录D为规范性附录，附录A～附录C、附录E、附录F为资料性附录本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心（江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室）、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。本标准验证单位：上海市环境监测中心、浙江省环境监测中心、江苏省环境监测中心、江苏省南京环境监测中心、江苏省苏州环境监测中心和江苏省泰州环境监测中心本标准生态环境部2019年4月13日批准。本标准自2019年9月1日起实施，本标准由生态环境部解释
水质致突变性的鉴别蚕豆根尖微核试验法1适用范围
本标准规定了鉴别水样致突变性的蚕豆根尖微核试验法本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的致突变性鉴别。2规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T6920水质pH值的测定玻璃电极法HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
微核micronucleibzxZ.net
真核细胞中，游离于主核之外的小核即为微核，其物质构成和特性与主核一致，大小一般为主核1/3以下，是染色体畸变的一种表现形式。3.2
微核率micronucleusrate
某一试样检测若干根尖，每个根尖观察1000个有丝分裂间期细胞，所计微核数占观察细胞数的比率，以%o计。
有丝分裂指数mitoticindex
同一根尖观察1000个细胞，处于有丝分裂期（包含前期、中期、后期、末期，见附录A图A.1）的细胞数占总细胞数的比率，以%o计。3.4
参比物质referencesubstance
验证测试方法敏感性和有效性的已知阳性对照物质，用于确定受试生物特性和试验条件未发生明显改变，保证试验可靠有效。4方法原理
将经过浸种催根后长出的蚕豆初生根在试样中暴露一定时间，经恢复培养、固定、染色1
后，制片镜检，统计蚕豆根尖初生分生组织区（参见附录A图A.2）细胞微核率。致突变物可作用于细胞核物质，导致有丝分裂期染色体断裂形成断片、整条染色体脱离纺锤丝、纺丝牵引染色体移动的功能受损。这些移动受到影响的染色体断片或整条染色体不能随正常染色体移向细胞两极形成子细胞核，而滞留细胞质中形成子细胞微核并引起其数量增加。比较试样与空白试样蚕豆根尖细胞微核率是否显著增加，可判定样品是否存在致突变性。5试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水，电导率（25℃）≤0.50mS/m、pH（25℃）在5.5~7.5之间。5.1调温水：用于浸种（8.2）、催根（8.3）、根尖处理（10.1）的实验用水，需提前放置于恒温培养箱（6.3）中，25℃土1℃平衡至恒温备用。5.2盐酸：p（HCI）=1.18g/ml。5.3氢氧化钠（NaOH）。
5.4乙酸：p（C2H402）=1.05g/ml。5.5无水乙醇：P（C2H0）=0.79g/ml。5.6碱性品红（C20H20CIN）。
5.7偏重亚硫酸钠（Na2S2Os）或偏重亚硫酸钾（K2S2Os）。5.8活性炭粉。
5.9环磷酰胺（CHisCl2N2O2P·H2O），生物试剂（BR），纯度≥99.0%，本标准参比物质。5.10盐酸溶液：c（HCI）=1.0mol/L。量取8.3ml盐酸（5.2），缓慢加入少量水中，搅拌混匀后用水定容至100ml。5.11氢氧化钠溶液：c（NaOH）=1.0mol/L。称取4.0g氢氧化钠（5.3），加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至100ml。5.12卡诺氏液（乙酸-无水乙醇混合液）：1+3。将乙酸（5.4）和无水乙醇（5.5）按1:3的体积比混合，临用现配。5.13乙醇溶液：Φ（C2H60）=70%。量取无水乙醇（5.5）70ml，用水定容至100ml。5.14席夫（Schiff）试剂：
可使用市售的成品试剂。也可按照以下方式配置：在100ml烧瓶中加入5.0ml无水乙醇（5.5）和0.5g碱性品红（5.6），振荡溶解10min。将2.5g偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶解于93ml水后，加入上述烧瓶中，混匀，继续加入1.5ml盐酸（5.2），避光振荡至完全溶解，此时溶液呈浅黄色。再加入0.2g活性炭粉（5.8），振荡3min，过滤溶液使之无色，保存备用。此溶液在4℃以下冷藏避光可保存6个月，如溶液呈粉红色或出现沉淀，则不可再用。5.15SO2漂洗液：w（Na2S20s或K2S2Os）=0.5%称取10.0g偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶于90ml水中，得到w（Na2S2Os或K2S20s）=10%的溶液。分别吸取该溶液和盐酸溶液（5.10）各5.0ml于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，临用现配。
5.16：乙酸分散液：Φ（C2H4O2）=45%。量取45ml乙酸（5.4），用水定容至100ml，临用现配。5.17环磷酰胺参比溶液：p（CHisCl2N202P）=20.0mg/L。称取0.107g环磷酰胺（5.9）加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至100ml。吸取该溶液20.0ml，用水定容至1000ml，临用现配6仪器和设备
配制环磷酰胺参比溶液（5.17）及试样稀释时使用符合国家标准的A级玻璃量器，其他可使用符合国家标准的B级玻璃量器。6.1冷藏采样箱：0℃～8℃。
6.2生物显微镜：物镜10×、20×、40×，目镜10×或15×。6.3恒温培养箱：25℃±1℃。
6.4冰箱：冷藏温度0℃~8℃，冷冻温度≤-18℃。6.5电子天平：分度值0.0001g。6.6恒温水浴锅：20℃～100℃，控温精度±1℃根尖处理皿：直径≥12cm、高度≥3cm，可自制（参见附录C）。6.7
生物实验室常用设备和器材。
受试生物
受试生物为松滋青皮豆，是原产于湖北省松滋县的一种中粒蚕豆（Vicia faba），经筛选及长期纯化保种，其遗传特性相对稳定，对致突变物较为敏感。可直接购买或自行保种，其特性及保种应符合附录B的要求。本试验以其初生根为受试器官。受试生物准备
8.1选种
按照每一试样约需50粒松滋青皮豆的数量，挑选颗粒饱满、豆皮青绿或青棕色、大小一致、无病虫害、表面无明显缺损的豆种，实验用水洗净。8.2浸种
按照每1000ml烧杯中最多300粒豆种的数量浸种，在烧杯中加调温水（5.1)过1000ml刻度，于恒温培养箱（6.3）中25℃±1℃避光浸泡至豆种充分吸胀。浸种约需26h～30h，可在18h和24h时换水，若出现浑浊，则增加换水频次。8.3催根
将医用纱布浸洗3次后拧干，叠4层垫入洁净的塘瓷盘内，加少量调温水（5.1）至纱布充分润湿。调温水（5.1）用量以倾斜糖瓷盘，在最低处见少量溢水为宜。豆种（8.2）用3
调温水（5.1）漂洗后，均匀排布于糖瓷盘内，覆盖2层充分润湿的纱布，纱布含水量以悬挂时刚好无水下滴为宜。盖上糖瓷盘盖，于恒温培养箱（6.3）中25℃±1℃避光催根62h~66h。
催根期间，每日检查2次，注意及时补水保持纱布处于刚被充分润湿的状态，随时去除不出根、霉变、根尖枯死、根尖形态或颜色异常的豆种，如下垫纱布出现粘性分泌物，及时清洗更换。
9样品
9.1样品采集
按照HJ/T91或HJ/T164的要求进行样品采集，根据样品性质选用1.000ml及以上容量的采样瓶。采样瓶可以为棕色玻璃瓶或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器。采样时应注意将样品沿瓶壁缓慢倒入采样瓶，样品与瓶塞之间不留空隙，注：为保证尽快开展测试，采样时间应尽量安排在催根（8.3）步骤的末期。9.2样品保存
样品采集后，于8℃以下冷藏避光保存，在48h内进行试验。样品若需长期保存，须充分混匀分装并留有适当空隙，于-18℃以下冷冻保存，保存期不超过2个月。9.3试样制备
样品在恒温培养箱（6.3）中25℃±1℃避光平衡至恒温，充分混匀后，加满至根尖处理Ⅲ（6.7），与盖板间略留空隙，待测。测试前按照GB/T6920方法测定并记录pH值。在-18℃以下保存的样品，应先在不超过25℃的水浴中轻微振荡解冻，或在8℃以下冷藏过夜解冻。注：试样适宜的pH值范围为5.5～8.5，过高或过低的pH值可能会对试验产生影响。当试验结果需包含该影响，或者调节pH值会引起样品物理变性、化学反应时，则不调节样品pH值：当样品pH<5.5或>8.5时，可用盐酸溶液（5.10）或氢氧化钠溶液（5.11）调节pH值至适宜范围。根据监测目的，可单独或同时对调节前、后的试样开展试验。9.4对照试样
9.4.1用实验用水代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于阴性对照试验的空白试样。
9.4.2以环磷酰胺参比溶液（5.17）代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于阳性对照试验的参比试样
10分析步骤
10.1根尖处理
挑选初生根长1.5cm～2.0cm且生长发育良好的豆种（8.3），在9.3步骤的每个根尖处4
理血中插入10~12粒豆种，确保根尖没入试样至少1.0cm，于恒温培养箱（6.3）中25℃±1℃避光放置6h
取出豆种，用调温水（5.1）浸洗3次（每次5min）后，按照8.3规定的条件恢复培养24h。
处理过程中，根尖如出现附录D中描述的急性毒性症状，则按附录D的要求增加试样急性毒性预试验；否则，直接进行后续试验。10.2根尖固定
切取顶端1.0cm左右根尖（10.1）置于具盖指管内（同一试样处理的根尖放入一个指管），加卡诺氏液（5.12）固定2h。固定时间最长不超过24h。如不能及时染色制片，则弃去卡诺氏液，用实验用水洗净，加入乙醇溶液（5.13）浸没于冰箱内冷藏，72h内染色镜检。10.3孚尔根（Feulgen）染色
实验用水浸洗根尖（10.2）2次，每次5min。取60℃水浴平衡后的盐酸溶液（5.10），快速加入指管内直至浸没根尖，指管加盖后放入60℃水浴锅中水解约10min，具体时间以根尖软化呈白色略带透明，镊子轻捏不破、有弹性为准。快速弃除盐酸溶液。立即用实验用水漫洗上述根尖2次，每次5min。在指管中加入席夫试剂（5.14）直至浸没根尖，在暗室或避光条件下染色1h～2h。弃除染液，用SO2漂洗液（5.15）浸洗根尖2次，每次5min；再用实验用水浸洗根尖2次，每次5min。如不能立即制片，将根尖浸泡于新换的实验用水中，冰箱内冷藏，48h内制片镜检。10.4制片
用镊子轻取染色效果良好的根尖（10.3），在滤纸上吸净表面水分，置于载玻片上，用手术刀截取约1.0mm~2.0mm处的顶部根尖（参见附录A图A.2），滴加1滴乙酸分散液（5.16）浸没根尖，手术刀充分捣碎，加盖玻片（避免产生气泡），盖玻片上叠放滤纸，轻轻敲打以分散根尖组织，拇指按压制成薄片，使根尖细胞呈单层分散状。10.5镜检
将制备好的压片（10.4）置于生物显微镜（6.2）下，低倍镜下观察找出根尖细胞接近方形或椭圆形、分布均匀、不重叠的区域，转入高倍镜下镜检。每一试样至少观察6个根尖，按10.6判定规则对每个根尖进行以下统计：a）1000个细胞中处于有丝分裂期的细胞数b）1000个处于有丝分裂间期细胞中的微核数。10.6有丝分裂细胞及微核判定
10.6.1细胞有丝分裂过程包含分裂间期和有丝分裂期两个阶段，其中有丝分裂期细胞的识别参见附录A图A.1。
10.6.2按照以下规则判定微核：5
a）大小为主核的1/3以下，且与主核分离或相切：b）着色反应和折光性与主核一致，内部有明显的染色质颗粒，色泽比主核稍浅或相c）形态圆形、椭圆形或不规则。形态类似微核，但不符合上述特征，尤其是折光性与主核不一致、内部无明显染色质颗粒、着色较深或过浅的颗粒即为伪微核。微核及伪微核判定参见附录A图A.3。10.7对照试验
10.7.1阴性对照
每批试样测试时，空白试样（9.4.1）按10.1～10.6步骤进行阴性对照试验10.7.2阳性对照
每批试样测试时，参比试样（9.4.2）按10.110.6步骤进行阳性对照试验。11结果计算与表示
11.1结果计算
a）每一根尖有丝分裂指数按公式（1）计算：I=
x1000%g
式中：I单个根尖有丝分裂指数（保留一位小数），%o；M观察1000个细胞中所有处于有丝分裂期的细胞数，个。b）被测试样微核率按公式（2）计算：MCN=
nx1000
x1000%
式中：MCN一被测试样的微核率（保留一位小数），%o：R，被测试样第i个根尖1000个有丝分裂间期细胞中的微核数，个；n—同一被测试样中观察根尖的总数（≥6），个。注：试样微核率、空白试样微核率和参比试样微核率分别以MCN试样、MCN和MCN参比表示。11.2结果判定
在本测定方法下，试样致突变性按以下条件判断(1)
a）MCN武样≤实验室历史累积MCN空白上限（参考值6.6%o），则该试样不存在致突变性；b）MCN式样>实验室历史累积MCN空白上限（参考值6.6%o），且本次MCN式样较MCN空白显著增加，则该试样存在致突变性；c）MCN式样>实验室历史累积MCN空白上限（参考值6.6%o），但本次MCN武样较MCN空白无显著增加，则该试样疑似存在致突变性。6
比较试样与空白试样的蚕豆根尖微核率是否存在显著性差异，可使用适当的统计学方法，例如非参数检验法（推荐使用Kruskal-Wallis检验方法），参见附录E。注1：实验室历史累积MCNn上限，即为实验室按本标准方法所得的空白试样微核率历史有效数据的99%置信上限值。
注2：本方法定性判定样品致突变性。对于具有致突变性的试样，也可在此基础上采用逐级稀释方法，依据不同稀释浓度试样致突变性存在与否的情况，求得该样品最大无致突变性效应浓度。
11.3试验报告
原始记录表和试验报告表格式参见附录F，试验报告要求包括但不限于下列信息：a）松滋青皮豆的来源和收获年份；b）样品的名称、类别、来源、保存方法，采样时间，试样pH调节前后的值等；c）存在急性毒性的试样，用于正式试验的无急性毒性效应最大浓度：d）每一试样对应的所有镜检根尖细胞有丝分裂指数的范围；e）每一试样对应的所有镜检根尖的微核数；f）对照试验结果中空白试样（阴性对照）和参比试样（阳性对照）微核率：g）试样微核率，试样与空白试样差异显著性比较的统计学方法、判断标准、计算结果、及样品致突变性鉴别结果，12精密度
6家实验室分别对空白样品（平均MCN=3.6%o），P=2.0mg/L（平均MCN=11.1%o）、p=20.0mg/L（平均MCN-23.3%o）、p=50.0mg/L（平均MCN=30.1%o）的自制环磷酰胺参比样品，阴性实际样品（地表水，平均MCN=3.9%o）、阳性实际样品（化工废水，平均MCN=8.6%o）的蚕豆根尖微核率进行了测定，每个样品均平行测定6次。实验室内的相对标准偏差范围分别为：16%~38%、10%~16%、8.7%~16%、7.3%~13%、25%~45%、15%~34%：实验室间的相对标准偏差分别为7.4%、8.9%、3.9%、3.6%、7.4%、4.2%。13质量保证和质量控制
13.1有丝分裂指数：试样、空白试样、参比试样等处理后的所有进行镜检的根尖，每一根尖的细胞微核计数区有丝分裂指数应>20%0，否则该根尖微核计数结果无效。13.2对照试验：对照试验结果符合下列要求，试验结果方为有效。否则，查明原因后重新进行试验。
a）阴性对照
根尖处理后，根尖不得有急性毒性症状，且MCN≤实验室历史累积MCN上限（参考值6.6%0）。
b）阳性对照
根尖处理后，根尖不得有急性毒性症状，且MCN参比=23.3%o±7.5%o，即15.8%~30.8%。7
废物处理
实验中产生的具有急性毒性或致突变性的废物按危险废物，其它按一般废物，分类集中收集，并做好相应标识，委托有资质单位进行处理。o
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