HJ 1190—2021.
警告:检测人员应采取必要的生物安全防护措施（包括但不仅限于一次性手套、口罩、防护服、防护眼镜、鞋套等防护用品）﹔检测时应做好无菌防护，在无菌操作设备内进行。
1适用范围
HJ 1190规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法。本标准适用于微生物实验室灭菌效果的评价。
规范性引用文件
HJ 1190引用了下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
《消毒技术规范》(原卫生部卫法监发〔 2002) 282号)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus subtilis var. niger
也称萎缩芽孢杆菌（Bacilluis atrophaeus)，在含酪氨酸的培养基上形成黑色素的革兰氏阳性芽孢杆菌。作为灭菌效果评价试验的指示菌种。
3.2
灭菌sterilization
用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和肮病毒蛋白，使之达到无菌保障水平。常用的灭菌方法有化学试剂灭菌〈如环氧乙烷、甲醛等)、射线灭菌（如y射线、电子束辐射等)、湿热灭菌、干热灭菌和过滤除菌等。
3.3
生物指示物biological indicator
含有对特定灭菌过程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。
注:生物指示物为特定灭菌过程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息，并规定该过程的置信水平。

中华人民共和国国家生态环境标准HJ1190—2021
ronment
灭菌生物指示物
（枯草芽孢杆菌
黑色变种
Water quality-
的鉴定
生物学检测法
-Identification of biological indicator ((Bacillussubtilisvar.
niger) for sterilization-Biological detection method本电子版为正式标准文本，由生态环境部环境标准研究所审校排版。ysw
2021-09-17发布
信息服务平
2022-04-01实施
适用范围
规范性引用文件，
术语和定义
方法原理
试剂和材料
仪器和设备
样品：
分析步骤…
结果与报告.
10灵敏性和特异性.
质量保证和质量控制
..废物处置.
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
........
...S...S...
染色．.
培养基和
培养基
............
.............
和染色液使用说明及结果观察
................
HJ1190—2021
.....2
信息服务平台
HJ1190—2021
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》，防治生态环境污染，改善生态环境质量，规范水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定方法，制定本标准。本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法，用于微生物实验室灭菌效果的评价。
本标准的附录A和附录B为规范性附录ent
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准主要起草单位：
本标准验证单位：浙江
上海市环境监测中心。
省生态环境监测中心、江苏省常州环境监测中心、华东师范大学、上海市松宁区环境监测站和上海市青浦区环境监测站。江区环境监测站、上海市长
本标准生态环境部2021年9
1百起实
本标准自2022年4
本标准由生态环境部解释
日批准。
实施。
信息服务平台
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灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定生物学检测法
警告：检测人员应采取必要的生物安全防护措施（包括但不仅限于一次性手套、口罩、防护服、防护眼镜、鞋套等防护用品）；检测时应做好无菌防护，在无菌操作设备内进行。1适用范围
本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法。本标准适用于微生物实验室灭菌效果的评价。n
2规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其
凡是未注日期的引用文
《消毒技术规范》
原卫生
的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。新版本（包括所有的修改单）
适用于本标准。
卫法监发（2002）282号）
3术语和定义
Baci//us
枯草芽孢杆菌黑色交种
subtilis var. niger
在含酪氨酸的培养基上形成黑色素的革兰氏阳性芽孢杆也称菱缩芽孢杆菌（Bacilatrophaeus），菌。作为灭菌效果评价试验的
增示菌
灭菌sterilization
用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非微生物、芽孢和病毒蛋白，使之达到无服务平台
菌保障水平。常用的灭菌方法有化学试剂灭菌（如环氧乙院甲等）、射线灭菌（如射线、电子束辐射等）、湿热灭菌、干热灭菌和过滤除菌等。3.3
生物指示物biologicalindicator含有对特定灭菌过程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。注：生物指示物为特定灭菌过程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息，并规定该过程的置信水平。1
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4方法原理
经灭菌处置后含枯草芽抱杆菌黑色变种芽袍的水样通过孔径为0.45um的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃土1℃培养72h～96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性5试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为蒸馅水。
见附录AST
酪氨酸琼脂培养基，
营养琼脂培养基，见附录A2
淀粉培养基和碘液，
见附录A
硝酸盐还原培养基和相关试
见附录A.4。
觅附录A.5。
甘油复红肉汤培养
甘露糖生化培养基
甘露醇生化培养基
见附录A.6。
见丽录A.6。
见附录A.7。
苦杏仁苷生化培养
见附录
革兰氏染色液，
芽孢染色液，见附录A.9
阴性对照菌：如地衣芽泡杆菌（Bacilluslicheniformis）阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种（Bailus subtilisvar.niger）变种芽孢悬液：按照《消毒技术规范》2.1.1.2.3（2）自5.13枯草芽孢杆菌黑色
的规定制备，也可购买浓
度范围在10cFU/ml～10°CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。5.14无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜按无菌操作要求包托，
经21℃高压蒸汽火菌20min，
验用水，煮沸灭菌3次，15m/次2次煮沸后需换水洗涤5.15石蜡质封口膜。
5.16无菌水：取适量实验用水，121
备用：
或将滤膜放入烧杯中，加入实
台压蒸汽灭菌20min，
也可采用市售的无菌滤膜。
注1：5.1~5.10的成分及制备方法见附录A，也可使中带售商品化培养基或染色液：服务平台
注2：5.11～5.12，建议购买由国内或国际菌种保藏机构保藏草学特性得到确认和保证并可追溯的标准菌株。6仪器和设备
样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶6.2恒温培养箱：36℃土1℃。
6.3高压蒸汽灭菌器：121℃，可调。6.4pH计：准确到0.1pH单位或更高精度。也可使用pH精密试纸，6.5显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×。6.6分析天平：实际分度值0.0001g。6.7培养皿：直径90mm。
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6.8过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50kPa。6.9接种环：直径1mm~3mm。
6.10镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。6.11刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可调式移液器。量筒：100ml。
锥形瓶：100ml。
6.14酒精灯。
6.15试管：10ml。
无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。一般实验室常用仪器和设备
注：试验前，移液管、样品瓶、培养血，锥形并
求包扎，高压蒸汽灭菌器
、试管、砂芯滤器、圆简形玻璃漏斗等玻璃器血应按无菌操作要6.3)121
也可采用干热灭菌（135℃~140℃灭C灭菌20min，烘干
备用。
170灭菌2h~4h，或180℃~200c灭菌0.5h~1h）。菌3h5h，或160℃
7样品
7.1样品采集
7.1.1评价使用高温高压灭需设备的灭菌效果时，取样品瓶（6.1)，加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13）及200ml无菌水（5.16）使混合液中枯草芽抱杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml~5×10°cFU/ml。灭菌处置完男后，取出样品瓶
的检测。
菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）7.1.2评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13）加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×10*CFU/ml5×10°CFU/ml。灭菌处
置完毕后，从灭菌设备中
采集永样
进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量般为样品瓶容量的80%大右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品C
7.2样品保存
样品采集后宜在2h内检测，
否则在0C以下冷藏保存运输，
α二冷藏保存，
后，不能立即开展检测的，样品应在4注：宜使用生物安全周转箱进行样品周转。8分析步骤
8.1方法程序
样品中枯草芽孢杆菌黑色变种的检测程序见图1。8.2样品过滤
但不得超过6h。实验室接收样品并在2h内检测。
息服务平台
用无菌镊子（6.10）以无菌操作夹取无菌滤膜（5.14）贴放在已灭菌的过滤装置（6.8）上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取100ml抽滤，以无菌水（5.16）冲洗滤器内壁2～3次。样品过滤3
IJ1190—2021
完成后，继续抽吸约5s，关闭过滤装置真空泵元关：过滤前按无菌操作要求调节样品的plI值至70~8.0。
酪氨酸琼脂培养基培养
36 ℃±1 ℃,
存菌落生长
挑取黑色或可頭
（灰色、灰黑色）菌落
革兰氏
8.3培养
枯草菜孢杆菌黑色变种
其它菌落
72h~-96h
无菊落牛长
未检出
枯草芽孢杆菌黑色变种
非枯草芽孢杆菌黑色变种
”表水反果阳
表示反应结果阳性
枯草芽阿杆黑色变种检测流程
8.3.1用无菌镊了（6.10）火取滤唢贴放在酪氢酸琼脂培养基（，1）上滤膜截留细菌的白向上，另-面应与培养基完全贴紧，滤膜和培养基之间不得留有（泡，然后用蜡质村膜（5.15）封闭培养Ⅲ选缘，培养Ⅲ倒置放入恒温培养箱（6.2）内，36℃生1℃音养72h96h8.3.2培养72h后，若音养基上有黑色或可疑（灰色、灰黑色）菌落生长，则挑取接不」营养琼脂培养基（5.2）上，36℃上1C培养24h，待鉴定，同时将已挑取茵落的酪妄氨酸琼脂培养幕培养Ⅲ在2℃～5℃储存：以备必要时复查。若培养基上无色或可疑菌落生长，则延长培养时间至96h，仍无黑色或可疑茵落生长，则试验终止，注：菌落颜色无法判断时，可市次划线接种至酪氨酸惊脂培养基（5.1）培养后观察。4
8.4鉴定
8.4.1染色镜检
IIJ1190—2021
挑取黑色或可疑菌落（8.3.2），分别使用革兰氏染色液（5.9）和芽泡架色液（5.10）染色，操作步骤及结果观索见附录B，然后镜检：杜草芽孢杆菌黑色变种革兰氏架色镜检结果见图2a），芽孢染色镜检结果见图2b）。枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性菌，营养细胞呈杆状，单个或三知链状排列：芽孢中牛、椭圆形、不膨大。ent
a）革兰氏染色（放大1000倍）
8.4.2生化试验
b）芽孢染色（放大1000倍）
枯草芽孢杆菌黑色变种染色镜检图芽孢
挑取黑色或可疑菌萃（832）：
分别接种到淀粉培养基（5.3）、硝酸盐还原培养基（5.4）、口油复红肉汤培养基（5.5）、山露糖牛化培养甚（5.6）、山露醇牛化培养基（5.7）和罩杏仁H牛化培养基（5.8）上，操作步骤及结果见究见附录B，若使用市售商品化培养基，则按使用说明书探作。8.5对照试验
空白对照
用无菌水（5.16）按照步骤8.2和8.3进行实验室究照试验培养96h后平板培养基上应无菌落牛长，否则，该次样品鉴生果无效，应查明原因后年新采样利检测
8.5.2阴性及阳性对照
将阴性对照菌（5.11）和阳性对照菌（5.12）制成浓度为40CFU/L～600CFLL菌液，分别按照8.28.4步骤操作。阿性、阳性对照菌呈现的牛化反应结果应与表1所列结果一致，否则该次样品鉴定结果无效，应否明原因届平新采样和检测。5
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特征指标
表1阴性、阳性对照菌应呈现的生化反应结果推荐菌株
酪氨酸琼脂培养基
革兰氏染色
芽孢染色
淀粉水解
硝酸盐还原
甘油利用
甘露糖利用
甘露醇利用
苦杏仁苷利用
注：“+”表示阳性，
9结果与报告
“二”表示阴性。
结果判定
可鉴定为枯
符合8.4、8.5，
结果评价
阴性对照菌
地衣芽孢杆菌
乳白色菌落
草芽孢杆菌黑色变种，结果判定为阳性古草芽孢杆菌黑色变种，评价为灭菌不合格：100ml样品中检出柜
合格。
菌黑色变种，评价为灭菌
灵敏性和特异性
灵敏性
阳性对照菌
枯草芽孢杆菌黑色变种
黑色菌落
100ml样品中未检出枯草芽孢杆
6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变礼泡悬液（以芽孢计）高浓度（10°CFU/100ml）、中浓度（10*CFU/100ml）、低浓度（10°CFU/10%ml）样高进行方法灵敏性检测，结果显示枯草芽孢杆菌黑色变种的检出率均为100%。
10.2特异性
6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变种阳性对照组和地衣芽孢杆菌阴性对组进行方法特异性检测，结果显示阳性对照组枯草芽孢杆菌黑色变种的检出率为100%，阴性对照组中草芽孢杆菌黑色变种的检出率为0。
质量保证和质量控制
每批样品均应进行空白对照试验、阴性对照试验、阳性对照试验。6
HJ11902021
11.2每20个样品或每批次样品（≤20个/批）检测一个平行样，若平行样与原样品的结果不一致时，则本批次试验无效，需重新检测。11.3应使用有证标准菌株对每批次培养基进行质量检验。12废物处置
实验产生的废物经121℃高压蒸汽灭菌20min～30min后，依法委托具备相应资质的单位进行处置。
信息服务平台
HJ11902021
A.1酪氨酸琼脂培养基
胰蛋白陈
葡萄糖
氯化钠
磷酸氢二钾
七水合硫酸镁
L-天冬酰胺
L-酪氨酸
干酪素
微量盐溶液
蒸馏水
其中微量盐溶液配
七水合硫酸亚铁
二水合氯化铜
六水合氯化钻
二水合钼酸钠
氯化锌
四水合二氯化锰
酒石酸钠
蒸馏水
A.1.2制备方法
附录A
（规范性附录）
培养基和染色液
Environme
1000ml
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，按配方顺序逐一加人营养分，待一种成分溶解后加入另一种成分，调节pH值至7.0左右。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，121压蒸汽灭菌15min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注25ml~30ml培养基，待用。8
A.2营养琼脂培养基
A.2.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制备方法
15g~20g
1000ml
HJ1190—2021
将除琼脂以外的各成分溶解于鑫馏水中，调节pH值至7.2-7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，121℃高压蒸汽灭菌15
min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml~25ml培养基，待用。
淀粉培养基和碘液
淀粉培养基
蛋白陈
酵母膏
牛肉膏bzxz.net
蒸馏水
2制备方法
5.0g~10.0g
15g~20g
1000ml
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中：阔节型值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融待冷却至50℃／35℃，每个培养血内分别倾注15ml～25ml培养化，121℃高压蒸汽灭菌20min。基，待用。
A.3.2碘液
A.3.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
配制方法
服务平台
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。9
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