标准号：GB/T 38580-2020
标准名称：微生物诱变育种技术规范
英文名称：Technical specification for mutagenesis breeding of microorganisms
标准格式：PDF
发布时间：2020-03-31
实施时间：2020-03-31
标准大小：6.59M
标准介绍：1范围
本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法。
本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等离子体和化学诱变育种。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB15193.19食品安全国家标准 致突变物、致畸物和致癌物的处理方法
本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法。本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等离子体和化学诱变育种。

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中华人民共和国国家标准
GB/T38580—2020
微生物诱变育种技术规范
Technical specification for mutagenesis breeding of microorganisms2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。TrrKAa-cJouakAa
GB/T38580—2020
本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、中国标准化研究院本标准主要起草人：张独、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、马爱进。1
1范围
微生物诱变育种技术规范
本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法。iriKAa~cJouakAa
GB/T38580—2020
本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等离子体和化学诱变育种。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件：凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件食品安全国家标准
致突变物、致畸物和致癌物的处理方法GB15193.19
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
中strains
面向工业、农业、食品、医药等用途，在发酵过程中发挥生理代谢作用的微生物。3.2
mutagenesis
通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法3.3
mutagenesisbreedingof microorganisms微生物诱变育种
以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变·并从突变群体中筛选出所需要的突变株，进而培育成新品种的育种方法
4要求
4.1人员
试验人员应熟悉基本微生物操作，在开展相关试验前应充分了解使用微生物、诱变剂存在的风险和安全操作规范，试验过程中做好相应防护。2设施与环境
具有能开展基本微生物试验的实验室或车间，配备相关水、电、气等基础设施：实验室生物安全等级需满足所诱变微生物的要求。
4.3诱变材料
4.3.1总则
诱变材料应遵循以下原则：
GB/T38580-2020
单个、分散的细胞，宜呈悬浮状态；b）
细胞核越少越好，最好是单核；按照菌种类型选择合适的培养条件·保证菌种具有旺盛的活力：e
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诱变材料制作过程应在超净工作台中进行，所加试剂和溶液应提前进行灾菌或过滤除菌操作。4.3.2菌悬液
将菌种接种至合适的培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到1×10°CFU/ml~1X10*CFU/mL。4.3.3孢子悬浮液
将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生大量孢子：用生理盐水洗脱并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散：过滤除掉菌丝体。最后用生理盐水悬浮得到均匀的孢子悬浮液，并将其浓度调整到1×10*CFU/ml～1×10*CFU/mL。4.3.4菌丝悬浮液
将菌种接种到合适的培养基中培养至产生大量生长旺盛的菌丝，取一定量菌液并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使菌丝断裂，过滤除去未断裂的菌丝。最后用生理盐水悬浮得到均匀的菌丝悬浮液，并将其浓度调整到1X10*CFU/mL~1X10°CFU/mL。4.3.5原生质体悬浮液
将菌种接种到合适的培养基上，培养获得大量新鲜菌丝或孢子，收集菌丝或孢子。用渗透压稳定剂洗涤两次并重悬，向重悬液中加人一定量破壁酶，在最适条件下酶解、定时取样于显微镜下观察原生质体释放情况。酶解完成后过滤除去未酶解的菌丝，离心收集原生质体，用渗透压稳定剂洗涤原生质体三次，并将其浓度调整到1×10°CFU/mL~1X10°CFU/ml。4.4诱变育种操作
4.4.1紫外诱变
紫外诱变育种操作要求如下：
a）参数设定：宜选择如下参数，紫外线波长260nm，紫外灯功率10W~30W，照射距离10cm~30cm。细菌、原生质体、链霉菌抱子悬浮液照射时间宜选择10s～90s.酵母、莓菌抱子悬浮液照射时间宜选择1min～10min。对于不同的微生物样品和诱变要求应优化选择合适的参数。
b）提前20min~30min开紫外灯。e
透变材料应置于带无菌搅拌子的玻璃平Ⅲ中，边照射边搅拌。d）
每个样品需设三个重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，不照射紫外光。e
诱变后所有步骤应在暗室红光灯下操作。处理完成后的材料和阴性对照应避光冰浴1h～2hg)
诱变后样品材料和阴性对照应进行梯度稀释，吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板·避光培养至产生单菌落。
h）应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。4.4.2常压室温等离子体诱变
常压室温等离子体诱变育种操作要求如下：2
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GB/T38580—2020
参数设定：宜选择如下参数，照射功率100W~120W，照射距离2mm，工作气体流量10L/min。a)
细菌、原生质体、链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择30s~5min，酵母、霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择1min6min。
每个样品应设三个重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，阴性对照不照射等离子体照射结束后，应立即把照射过样品放人准备好的预先加人培养基的无菌离心管中，混合均匀。处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。
应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。e)
化学诱变
化学诱变要求如下：
化学诱变剂的选择：宜根据诱变材料和诱变要求选择合适的化学诱变剂，常用的化学诱变剂及其配制方法参见附录A和附录B。化学诱变剂浓度：不同微生物常用诱变剂浓度及处理时间参见附录C。b)
在诱变材料中分别加人不同浓度梯度的诱变剂工作液，混匀后处理不同时间。如需要应再加人反应终止液终止反应·离心·弃掉上清，用无菌去离子水洗涤诱变处理过的菌体每个诱变剂量组或每个处理时间组应设三个重复，阴性对照组不加入化学诱变剂，以加人等量d）
无菌水代替。
处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。
应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。化学诱变剂使用后应按GB15193.19的方法进行处理5
证实方法
诱变结果以致死率表示，致死率按式(1)计算：Ce-CT
式中：
致死率；
阴性对照平板菌落数；
试验组平板菌落数。
·（1)）
GB/T38580-—2020
（资料性附录）
化学诱变剂种类、作用机制及常用化学诱变剂化学诱变剂的种类、作用机制及常用化学诱变剂见表A.1。表A.1
化学诱变剂种类
碱基类似物
烷化剂
移码诱变剂
氧化类诱变剂
金属离子
作用机制
常用诱变剂
5-溴尿嘧啶（5-BU）
5-氟尿嘧啶（5-FU)
代替DNA中的正常碱基
对DNA分子中碱基
的烷基化修饰
移码突变
DNA碱基氧化损伤
机制尚不清楚
6-氮杂尿嘧啶（6-NU）
2-氨基嘌呤（2-AP)
6-巯基嘌呤（6-MP）
8-氨鸟嘌呤（8-NG)
亚硝基乙基脲
亚硝基胍
硫酸二乙酯
硫酸（磺酸）酯类
甲基磺酸甲酯
甲基磺酸乙酯
吖啶橙
原黄素
亚硝酸（及其盐）
锰离子
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B.1亚硝基胍(NTG)
配制方法如下：
附录B
（资料性附录）
常用化学诱变剂配制方法
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GB/T38580-—2020
pH6.0磷酸缓冲液：分别配制0.2mol/L.的NaHPO·2H0溶液、0.2mol/L的NaHPO：2H0溶液·前者取出12.3mL.后者取出87.7mL.两者混合即得pH6.0的磷酸缓冲液1mg/ml.亚硝基肌溶液：称取50mg亚硝基胍.用5mL内酮溶解.4℃保存。用之前向其中加入45mL.pH6.0磷酸缓冲液，振荡使其充分溶解，过滤除菌。诱变终止剂：0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠缓冲液。取磷酸二氢钠2.507g溶于100ml.无菌水中，过滤除菌。
亚硝酸钠（NIT）
配制方法如下：
pH4.5醋酸缓冲液：称取醋酸钠18g.冰醋酸9.8mL于1L烧杯中.加入少量蒸馏水溶解，移入1.000mL容量瓶中定溶，充分混匀过滤除菌，4.℃保存备用。-0.1mol/L亚硝酸钠溶液：取亚销酸钠0.69g，溶于100ml.无菌水中，过滤除菌。使用时与pH4.5的醋酸缓冲液以1：2的体积比混合后使用。诱变终止剂：25%的NaS0溶液。称取4gNaSO·5H，0.溶解于6ml.蒸馏水中放置在4℃冰箱中备用，使用时过滤灭菌。与诱变液的体积比为1：1。B.3硫酸二乙酯（DES）
配制方法如下：
硫酸二乙酯不溶于水，溶于乙醇或乙醛醚半衰期短，在30℃条件下半衰期为1h，所以需要现用现配。取0.5mL.DES溶解于4.5mL无水乙醇中，配制成10%的储备液，过滤除菌。B.4甲基磺酸乙酯（EMS）
配制方法如下：
pH7.0的磷酸缓冲液：称取KHPO,3HO9.39g与KHPO3.5g，加蒸馏水定容至1000mL过滤，121℃灭菌15min或115℃灭菌30min；准确称取5.408gEMS粉末于10mL容量瓶中，先加人6mLpH7.0的磷酸缓冲液溶解，后定容至10mlL.配成5.0mol/L的母液，4℃保藏.临用前过滤除菌。5
GB/T38580-2020
附录C
（资料性附录）
常用化学诱变剂诱变条件及致死率常用化学诱变剂诱变条件及致死率见表C.1。表C.1
诱变剂
亚硝酸钠(NIT)
亚硝基胍（NTG）
硫酸二乙酯
工作浓度
0.05mol/L
0.025mol/L
2mg/mL
0.025mol/L
0.025mol/L
0.05mol/L
0.025mol/L
2mg/mL
1mg/mL
1mg/mL
诱变菌种
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真菌菌丝悬液
绿色木孢子
茂源链霉菌孢子
粘带霉菌孢子
白腐真菌孢子
平贝母内生真菌
丝悬液
蜡状芽抱杆菌
菌悬液
茂源链霉菌抱子
蜡状芽孢杆菌
菌悬液
枯草芽孢杆菌
菌悬液
植物乳杆菌菌
放线菌孢子悬液
粗壮脉纹孢菌
抱子悬液
绿色木霉孢子
山东链霉菌莓
诱变时间
10min~20min
致死率
85%~95%
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诱变温度
25℃~26℃
诱变剂
硫酸二乙酯
甲基磺酸乙酯
氯化锂
工作浓度
表C.1（续）
诱变菌种
嗜热厌氧菌菌
蜡状芽孢杆菌菌
放线菌孢子悬液
酿酒酵母
乳酸杆菌菌液
放线菌孢子悬液
诱变时间
致死率
70%80%
TriKAa-cJouakAa
GB/T38580—2020
诱变温度
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