标准号：WS 283-2020
标准名称：炭疽诊断
英文名称：Diagnosis for anthrax
标准格式：PDF
发布时间：2020-04-21
实施时间：2020-11-01
标准大小：885K
标准介绍：本标准代替WS283-2008《炭疽诊断标准》。本标准与WS283-2008相比，主要技术指标变化如下：
一增加了规范性引用文件(见第2章)
一修改了实验室检查(见4.3,2008年版的3.3)
一修改了临床诊断病例的诊断(见6.2,2008年版的5.2)；
一修改了确诊病例的诊断(见6.3,2008年版的5.3)；
一增加了标本保存和运输要求(见附录A)；
一增加了生物安全要求(见附录B)
一増加了炭疽芽胞杄菌的核酸检测(见附录D)；
一增加了炭疸芽胞杆菌的抗原检测(见附录E)。
本标准规定了炭疽的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。
本标准适用于全国各级各类医疗机构及其医务人员对炭疽的诊断。

ICS11.020
中华人民共和国卫生行业标准
WS283—2020
代替WS283—2008
炭疽诊断
Diagnosisforanthrax
2020-04-21发布
2020-11-01实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布前言
本标准第6章为强制性条款，其余为推荐性条款，本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替WS283—2008《炭疽诊断标准》。本标准与WS283一2008相比，主要技术指标变化如下：增加了规范性引用文件（见第2章）：修改了实验室检查（见4.3，2008年版的3.3）：修改了临床诊断病例的诊断（见6.2,2008年版的5.2）：修改了确诊病例的诊断（见6.3,2008年版的5.3）；增加了标本保存和运输要求（见附录A）：增加了生物安全要求（见附录B）：增加了炭疽芽胞杆菌的核酸检测（见附录D）；增加了炭疽芽胞杆菌的抗原检测（见附录E）。WS283—2020
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、辽宁省疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京地坛医院、四川省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所、陕西省疾病预防控制中心、沈阳市第六人民医院。本标准主要起草人：魏建春、李伟、姚文清、李兴旺、罗隆泽、殷文武、郭学军、刘东立、毛玲玲、张明香、张恩民、张慧娟。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB17015—1997；
—WS283-2008。
行业标准信息服务平台
1范围
炭疽诊断
本标准规定了炭疽的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断本标准适用于全国各级各类医疗机构及其医务人员对炭的诊断。规范性引用文件
WS283—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用手本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1炭疽anthrax
由炭疽芽胞杆菌引起的一种人兽共患急性传染病。主要发生于畜间，以牛、羊、马等草食动物最为易感。人主要通过接触患炭疽的动物或污染的动物制品、环境感染而惠病。主要临床类型为皮肤炭疽少数为肺炭疽和肠炭疽，可以继发败血症及脑膜炎。皮肤炭疽病死率较低，其他各型炭疽的病死率均较高。
行业标
4诊断依据
4.1流行病学史
发病前14d以内，接触过疑似炭疽的死动物或其残骸，或食用过疑似炭疽的病、死动物肉类或其制品，或吸入可疑炭疽芽胞杆菌污染的粉尘，或从事与毛皮等畜产品密切接触、与炭疽芽胞杆菌研究使用相关的职业，或在可能被炭疽芽胞污染的地区从事养殖、放牧、耕耘或挖掘等活动。总服务
4.2临床表现及分型
4.2.1皮肤炭疽
手、前臂、面、颈等暴露部位的局部皮肤出现不明原因的斑疹、丘疹、水疱，周围组织肿胀及浸润继而中央坏死形成溃疡性黑色焦痴，焦痴周围皮肤发红，肿胀，疼痛不显著，稍有底。典型皮肤损害表现为具有黑痴的浅溃疡，周边有小水疱，附近组织较为广泛的非凹陷性水肿。除皮损外，患者多出现发热、头痛、关节痛、全身不适以及局部淋巴结和脾肿大等症状和体征。少数严重病例，局部呈大片水肿和坏死。
4.2.2肠炭疽
WS283—2020
发热，腹胀，腹部剧烈疼痛，腹泻，通常为血样便或血水样便。可有恶心、呕吐，呕吐物中可含血丝及胆汁。可伴有消化道以外症状和体征，4.2.3肺炭疽
高热，呼吸困难，可有胸痛及咳嗽，咳极黏稠血痰。肺部体征常只有散在的细湿啰音。胸部X线的主要表现为纵隔影增宽，胸腔积液4.2.4脑膜炎型炭疽
剧烈头痛，呕吐，颈项强直，继而出现谱妄、昏迷、呼吸衰竭，脑脊液多为血性。多继发于4.2.1～4.2.3，也可能直接发生。免费标准bzxz.net
4.2.5败血症型炭疽
高热、寒战，感染性休克与弥漫性血管内凝血（DIC）表现，皮肤出现出血点或大片淤斑，腔道出血，迅速出现呼吸与循环衰竭。多继发于4.2.1～4.2.3，也可能直接发生。4.3实验室检查
4.3.1患者临床标本，细菌分离培养获得炭疽芽胞杆菌（见附录A、附录B）。4.3.2患者血清标本，抗炭疽特异性抗体检测阳性（见附录C）。4.3.3患者临床标本，显微镜检查发现大量两端平齐呈串联状排列的革兰阳性大杆菌。4.3.4患者临床标本，炭疽芽胞杆菌特异性核酸片段检测阳性（见附录D）。4.3.5惠者临床标本，炭疽芽胞杆菌抗原检测阳性（见附录E）。4.3.6暴露动物标本或暴露环境标本，细菌分离培养获得炭疽芽胞杆菌（见附录A、附录B）。5诊断原则
限务平台
根据流行病学史、临床表现、实验室检查等进行诊断。行业标准
6诊断
6.1疑似病例
6.2临床诊断病例
符合下列一项可诊断为临床诊断病例：a）疑似病例，并具有4.3.2～4.3.6中任何1项者：b）具有明确的流行病学史，并具有典型的皮肤损害者。6.3确诊病例
符合下列一项可诊断为确诊病例：a）疑似病例或临床诊断病例，并具备4.3.1者：疑似病例或临床诊断病例，并具备4.3.2中患者双份血清抗炭疽特异性抗体出现阳转或滴度出b）
现4倍或4倍以上升高者：
疑似病例或临床诊断病例，并具备4.3.2～4.3.6中任何2项者。c）
鉴别诊断
7.1皮肤炭疽
WS283—2020
炭疽病灶早期有明显水肿，有痒无痛，并不化脓。可与疗、蜂窝织炎、恙虫病的焦痴、羊痘、鼻疽、鼠疫、土拉热、丹毒、梅毒硬下、脓性溃疡相鉴别。患者的职业和病畜接触史可供参考。7.2肠炭疽
肠炭疽早期应与食物中毒、出血性坏死性肠炎、痢疾、急腹症相鉴别。7.3肺炭疽
肺炭疽黏性血痰与大叶性肺炎之泡沫状铁锈色痰相鉴别，并与肺鼠疫、钩端螺旋体病肺弥漫性出血型相鉴别。胸膜炎的积液为血性黏稠液。行业标准信息服务平台
A.1患者标本的采集
A.1.1采集标本时应遵循的原则
附录A
（规范性附录）
炭疽标本采集、保存和运输
A.1.1.1尽可能在抗生素治疗开始前采集标本。WS283—2020
A.1.1.2除必要时并在具备操作条件的实验室内，不得用解部的方式获取标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。
A.1.2血液标本
所有疑似病例，都应无菌操作采集血液标本5mL，用于显微镜检查、培养、抗原和核酸检测，并留取血清做抗体检测。应在恢复期再次采集血液标本5m，留取血清做抗体检测A.1.3皮肤病灶标本
在水疱期，用两根无菌棉签蘸取水疱液；在溃疡期，用两根生理盐水湿润的无菌棉签在皮损处涂抹在焦狮期，用两根生理盐水湿润的无菌棉签在焦痴处反复涂抹。标本用于显微镜检查、培养、抗原和核酸检测。
A.1.4粪便与呕吐物标本
表现消化道症状的疑似病例收集粪便或呕吐物标本，特别注意选取其中混有血液的部分，置无菌容器中。标本用于显微镜检查、培养、抗原和核酸检测。A.1.5鼻（咽）或癌标本
表现呼吸道症状的疑似病例采集其鼻（咽）拭子或痰液标本，用于显微镜检查、培养、抗原和核酸标准信
检测。
A.1.6脑脊液标本
表现脑膜刺激症状的疑似病例，腰椎穿刺获取脑脊液，标本量1mL～2mL。用于显微镜检查、培养，惠服务
抗原和核酸检测。
A.1.7户体标本
死亡病例可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本用于显微镜检查、培养、抗原和核酸检测。
A.2动物标本及环境标本的采集
A.2.1动物组织标本
血液、肉类、内脏等，视具体情况采集，用于培养。4
A.2.2环境标本
采集病死动物血液污染的土壤、水、其他物品等，用于培养。A.3标本采集生物安全要求
WS283—2020
标本采集时应采取传染病二级防护措施，使用医用防护口罩、医用乳胶手套、工作帽、医用防护服、防护鞋，必要时佩戴防护眼罩/面罩。A.4标本保存要求
用于培养和核酸检测的标本于2℃～8℃冷藏保存，低温运输。用于血清抗体检测的血清标本于-20℃以下冷冻保存，保持冷冻运输。运输要求
标本或菌株运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》执行炭疽芽胞杆菌菌株或活菌培养物，应按UN2814的要求包装和空运，其他相关样本均按UN3373的要求包装和空运；通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。行业标准信息服务平台
B.1生物安全要求
附录B
（规范性附录）
炭疽细菌学检查
应按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》要求执行。B.2显微镜检查
WS283—2020
所有来自患者或户体的标本，都应首先立即涂片，革兰染色，进行显微镜检查。如发现大量两端平齐的革兰阳性大杆菌，即可作为诊断依据。B.3细菌分离培养
B.3.1标本处理
皮肤病灶标本、血液、脑脊液、鼻（咽）拭子、痰液、尸检标本、动物组织等标本直接涂布血平板或营养琼脂平板，血液标本也可直接接种血培养瓶。环境标本、粪便及呕吐物标本，用两倍量蒸馏水或生理盐水制成悬液，经自然沉淀除去粗大颗粒物后，所得的悬液取1mL于65℃加热15min～20min后，取100～200μL涂布平板。
B.3.2挑选可疑菌落
上述平板在37℃孵育8h～24h后，检查是否长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。炭疽芽胞杆菌菌落的行业标准
形态为：灰白色、不透明圆形或不规则形状、表面呈毛玻璃样，低倍镜下菌落呈卷发状。血平板上不溶血或微溶血。
B.4炭疽芽胞杆菌鉴定
将上述可疑菌落挑出，划线接种于营养凉脂一板，在划线区内一处滴一滴诊断用炭疽噬菌体，另处贴一片青霉素药敏纸片。37℃孵育8h～24h后，在滴菌体处有透明噬菌斑，青霉素药敏纸片周围服务平台
有明显的抑菌环，便可判定接种物为炭疽芽胞杆菌。可疑落也可进行核酸检测，检出炭疽芽胞杆菌特异性核酸片段可判定为炭疽芽胞杆菌（见附录D）。6
C.1标本要求
附录C
（规范性附录）
炭疽血清学检查
WS283—2020
需采集患者急性期和恢复期双份血清进行检测。急性期血清应在首次检视病人时采集，血清分离后首先取少量进行一次抗体检测，其余置-20℃以下保存，待获得恢复期血清后，两份血清再一同进行抗体检测。可采用酶联免疫吸附试验、免疫层析法或其他免疫学方法进行检测。C.2酶联免疫吸附试验（ELISA）C.2.1试剂选择
可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作，也可按以下步骤进行操作。C.2.2试剂准备
C.2.2.1ELISA包被液
0.01mo1/L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4：称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4·12H20，0.3gKHPO4·2H20，加双蒸水900mL左右，用HC1/Na0H调节pH至7.4，最后定容至1000mL，15psi（1.05kg/cm）高压蒸汽灭菌。
C.2.2.2洗涤液
吸取5mL吐温-20加入995mL0.01mo1/LPBS中，混匀。C.2.2.3血清稀释液
取0.1mo1/LPBS20mL，加双蒸水160mL，加脱脂奶粉10g，加1mL吐温-20，混匀，调节pH至7.4，用双蒸水定容至200ml4℃保存，两周内使用。标达
C.2.2.4ELISA稀释液
除吐温-20的含量为0.1%外，其他成分一使用要求同血清稀释液。信息服务平
C.2.2.5显色液
3,3'，5,5”-四甲基联苯胺（TMB）溶液即用型。C.2.2.6显色终止液（0.5mol/LH,S04）取2.72mL浓度为98%的浓硫酸，缓慢加入90mL水中，混匀，加水定容至10gmL。C.2.3酶标板包被
本方法检测目标为患者血液内针对炭疽芽胞杆菌保护性抗原的抗体，使用保护性抗原包被酶标板。也可使用其他炭疽芽胞杆菌特异抗原成分包被酶标板，操作方法可按不同试剂盒说明进行调整。将抗原用ELISA包被液稀释至1.0μg/mL，酶标板所用各反应孔加入100μL，置4℃包被过夜，7d内使用。临用前每孔加洗涤液300μL洗涤3次，每次3min。7
C.2.4加入待检血清
C.2.4.1样品初筛实验
根据实际情况可略过此步骤，直接进行C.2.4.2。WS283—2020
血清标本用血清稀释液稀释至1：50加入酶标板，两孔平行检测，每孔100uL。每板做试剂、阳性血清和阴性血清对照孔，各3孔平行检测。酶标板置37℃湿盒中孵育60min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤液300uL洗涤3次，每次3min。C.2.4.2复判实验
初筛实验阳性的血清标本进行复判实验。待检血清首先用血清稀释液稀释至1:50，将稀释好的血清加入酶标板首行，使用两孔平行检测，再用ELISA稀释液倍比稀释，至少稀释至1:3200，每孔100μL。每板做试剂、阳性血清和阴性血清对照孔，各3孔平行检测。酶标板置37℃湿盒中孵育60min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤液300μL洗涤3次，每次3min。C.2.5酶标抗体反应
于各反应孔中加入用ELISA稀释液稀释的工作浓度辣根过氧化酶标记抗人IgG100uL，置37℃湿盒孵育60min。再用洗涤缓冲液洗涤3次，每孔300μL，每次3min。C.2.6显色
于各反应孔中加入显色液100uL，置暗处20min。每孔加入显色终止液100μuL，终止显色。C.2.7结果判断
终止显色后30min内，用酶标仪在波长450nm处，以试剂对照孔调零后测各孔OD值。阴性血清和阳性血清的OD值应在质控要求的范围内。被检孔OD值大于阴性血清2.5倍的血清，定义为阳性，对应的最大稀释度，定义为阳性滴度
C.3胶体金免疫层析法
C.3.1标本准备
慧服务
C.3.2检测
拆开炭疽芽胞杆菌抗体检测试剂的包装，将稀释的患者血清150uL～260也滴入加样孔内。2min后开始观察结果，15min终止观察C.3.3判读结果
出现两条紫红色色带，即质控线（C）和检测线（T）均显色为阳性结果；仅质控线显色为阴性结果：无条带出现或仅有检测线出现，说明试剂失效，应更换试剂重新检测。8
附录D
（规范性附录）
炭疽芽胞杆菌的核酸检测
D.1聚合酶链式反应（PCR）检测炭疽芽胞杆菌特异基因D.1.1
目标基因
WS283—2020
从标本中检测炭疽芽胞杆菌核酸时，以炭疽芽胞杆菌毒素基因和荚膜合成相关基因作为目标基因，也可选择其他特异性基因。
试剂选择
可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作，也可按以下步骤进行。D.1.3参考引物
参考引物序列见表D.1。合成的引物通常为冻干产品，开盖前应进行短暂离心，使用时需要溶解并稀释成储存液。按照10uL/nmol的量加入纯水，即可配制成100μmo1/L储存液，用时稀释10倍即为工作浓度（10umol/L）。
表D.1PCR用参考引物序列
目标基因
保护性抗原基因
荚膜合成相关基因
模板制备
试剂盒法
引物名称
pagA R
(5°-3°)
ATTTGCGGTAACACTTCACT
AGACCGTGACAATGATGGAA
CCTGGTTGTTCTTTCGTTGC
CGGATTGTATATGGAGTGGG
标准信
扩增片段长度
原始标本使用商品化基因组DNA提取试剂盒，实体操华方法按试剂盒说明进行。D.1.4.2煮沸法
已经分离培养的细菌菌落使用煮沸法进行简易模板制备。细菌按种于营养琼脂平板，37℃培养18h～24h；刮取菌苔1接种环（约2～5μL）放入装有800uL纯水或TE的1.5㎡心管内，混匀；100℃加热10min；12000×g离心10min：吸取上清用0.22um滤器过滤：滤液即为PCR模板。D.1.5PCR反应体系
一次总量25uL的反应体系包含：酶和缓冲液（2×）12.5μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10umol/L）各1μL，待测模板1uL～5μL，用纯水补足体积至25μL。9
WS283—2020
反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照：用已知炭疽芽胞杆菌模板作为阳性对照。加样顺序：首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。D.1.6PCR扩增
95℃预变性5min：95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环：最后72℃延伸5min。
D.1.7PCR扩增产物的检测分析
PCR产物各取5uL与1uL上样缓冲液混匀，加入1%琼脂糖凝胶的加样孔内，每块胶上加DNA分子量标准1~3孔，每孔5uL，6V/cm电泳40min。PCR产物也可进行测序分析。
D.1.8结果判读
在紫外透射仪或凝胶成像系统中观察结果，当阴性对照和阳性对照成立时，如炭疽芽胞杆菌的特异基因扩增阳性，则表明标本阳性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需更换试剂重新进行检测。测序结果与炭疽芽胞杆菌特异基因序列匹配，表明标本阳性。D.2实时荧光定量聚合酶链式反应（Rea-TimePCR）检测炭疽芽胞杆菌特异基因D.2.1
目标基因
同D.1.1。
D.2.2试剂选择
可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作，也可按以下步骤进行。D.2.3参考引物和探针序列
参考引物和探针序列见表D.2，引物和探针稀释方法同D.1.3。表DReal-TimePCR参考引物和探针序列目标基因
保护性抗原基因
荚膜合成相关基因
引物探针名称
上游引物pagA-F
下游引物pagA-R
探针pagA-P
上游引物cap-F
下游引物cap-R
探针cap-P
(5-3°)
GCGACCGTACTTGAATTCGAA
TGCGTCCTTCTTTGTA\TGGT
TCCTGCAGATA CALTCC
ATGGTAACCCTTGTCTTTGAATEG
TTGAATTCCGTGGTATTGGAGT
TTTGCAATTAATCCTGGAACAA
注：探针5端标记FAM荧光基团，3＇端标记淬灭基团D.2.4模板制备
同D.1.4。
D.2.5Real-TimePCR反应体系
GC含量
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