GB/T 39920-2021.Quarantine protocol for infection with Ranavirus.
1范围
GB/T 39920给出了两栖类动物蛙病毒感染(infectionwithRanavirus)的临床症状,规定了蛙病毒感染的病原分离培养、聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测方法。
GB/T 39920适用于蛙病毒感染的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
CPE:细胞病变效应(eytopathie efect)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵( cetyltrimethylammonium bromide)
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸( deoxyadenosine triphosphate)
dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核背酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸( deoxyguanosine triphosphate)
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy-ribonucleoside triphosphate)
dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸( deoxythymidine triphosphate)

ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T39920—2021
蛙病毒感染检疫技术规范
Quarantine protocol for infection with Ranavirus2021-04-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-11-01实施
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本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。GB/T39920—2021
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩由中华人民共和国农业农村部提出：本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市水产技术推广站、北京海关本标准要起草人：工娜、张夏、徐立蒲、景宏丽、张舟、李霆、张水宁张利峰、吴绍弱、张文、江育林rrKaeerkAca-
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1范围
蛙病毒感染检疫技术规范
GB/T 39920—2021
本标准给出了两栖奖动物蛙病毒感染（infectionwithRanazrts）的临床症状，舰定了鞋病毒感染的病原分离培养、聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测方法。本标雅适用丁蛙病荐感染的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测：2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用丁本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件G3/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫来样
3缩略语
下列缩略语适用丁本文件。
bp：碱基对（basepair）
(CPE:细胞病变效应(cytopathic cffcct)）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（ceiyltrimethylammoniumbromide)DVA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dATP：三磷酸腺嘌岭脱氧核甘酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTP：三磷酸胞嘧啶脱氨核苷酸（deoxycytidinctriphosphate）dGTP：磷酸鸟嘌岭脱氧核苷酸（deoxyguanosinetriphosphale）dVTP：脱氧核糖核磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（deoxythymidinetriphosphate）EB：溴化乙锭（cthidiumbromide）EDTA：乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）EPC：鲤上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprinicellline）HEPES：4-羟乙基哌嗪乙酸_4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonieacidIgG：免疫球蛋白G(immunoglobulinG)MCP：主衣壳蛋白（majorcapsidprotein）OD：光密度（opticaldensity）PBST：含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(phosphalebulleredl salineTween-20)PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction）Taq：水生栖热菌（thcrmusaquaticus）TM3.3.3’,5.5'-四甲基联苯胺(3.3’,5,5'-Tetramcthylhcnzidinc)1
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GB/T39920—2021
4试剂或材料
4.1水：符合GB/T 6682.一级
蛙病毒参考株：出农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供4.2
蚌病毒单克隆抗体：由农业农利部水生动物防疫主管部门指定机构提供。4.4
羊抗蛙病毒血清：由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供。酶标兔抗山羊1g。
细胞系EPC。
Tay DNA聚合酶：5/uL—20℃保存dVTP:含 dCTP,dGTP,dATP、dTTP各 2.5 mmol/L.-20℃保存MgCl：25mmol/L.-20℃保存，
物：浓度为10umol/1s
正向引物 F:5'CGC-AGT-CAA-GG-CTT-GAT-GT 3' :反向引物R:5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3b)
扩增蛙病寺主衣壳蛋白（MCP)编码基因预期长度为585bpc
无水乙醇：分析纯，使用前一20℃预冷4.11
琼脂糖：电纯，
封闭液：1%明胶
终止液：2 mol/l.的硫酸，
5仪器设备
超净T作台。
生化培养箱。
倒置显微镜。
普通冰箱及超低温冰箱。
冷冻离心机，
高压灭菌锅。
组织研磨器。
PCR仪，
电泳仪。
微波炉
凝胶成像仪：
酶标仪，
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皮肤溃疡和/或远端肢体坏死，参见附录A.2
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7样品
GB/T39920—2021
按GB/T18088的规定执行。来集活的两栖类动物。体长小丁3cm的，切除头和尾，取余下组织体长为3cm6cm的取所有内脏：体长大工6cm的，瑕肝肾脾8病毒的分离和检测
8.1病毒分离培养
8.1.1样品处理
用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1：10的比例将其重悬于含有1000IU/mL青素和1000g/ml.链素的培养液（见附录[3中13.1)巾，于15℃下孵2h~4h或1℃下孵个6h24h，70001/min.4℃离心20min.收集上清液8.1.2病毒接种与观察
8.1.2.1用细胞培养液对1*10的组织勾浆上清液再做2次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度的上清液接种到牛长约24h的EPC单层细胞上（96孔板巾），每个样品至少按利3孔，每孔接种100L,置于25℃培养。试验设置3孔阳性对照（接种病参考株）和3孔空白刘照（未接种病毒的细胞）。
8.1.2.2逐日用倒置显微镜观察细胞病变效应(CPE)是否出现，连续观察7d：如果7d内接种组织勾浆上清液的细胞培养物未出现CPE，需言传一次。育传时，将接种组织匀浆上清液的细胞培养物冻融一次后收集，7000r/min，4“C离心20min，收集清液。将「清液100l.接种到同种长满单层新鲜细胞的96孔板巾，置于25℃培养，再观察7d8.1.2.3如果空白对照细胞形态正常，阳性对照孔细胞出现CPE，当接种被检匀浆「:清烯释液的细胞或言传后的细胞出现CPE时.应立即取病毒恩液用PCR或EI.ISA方法进行病毒的检测。如果仅有阳I性对照出现CPE.样品经过接种细胞和育传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如果阳性对照未出现CPE，则试验无效，应重新迹行试验8.2PCR 检测
8.2.1样品处理
如果是组织样品取50mg~100mg组织。先加人150LCTAB溶液（见B.3），用组织研磨器将样品寸浆成糊状.放入1.5mL的离心智巾，再将CTAB落液补加至900uL：如果是出现CPE的细胞悬液，则取450L细胞悬液加人450μLCTAB溶液混匀：25℃作用2h~-2.5h。8.2.2DNA 抽提
在含有样品的离心管中加人600ul.抽提液1（见3.4），充分混合不少于30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL），再加人700μL抽提液（见B.5），充分混合至少30s。12000r/min离心5min，取1层水相（约600ml.）.再加入一20℃预冷的1.5倍休积的无水乙醇（约900ml），倒置数次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min，小心弃去上清：十燥后加20μl水溶解，用作PCR模板。
注：他可使用同等抽提效果的共他方法或使用商品化试剂盒抽提病声LVA。-riKacerKAca-
GB/T 39920—2021
8.2.3PCR扩增
在PCR管巾加入以下试剂：10×PCR缓冲液（不含Mg）10μl、25mmol/L的MgCl10μL、dNTP8μL、上下游可物各2.5μL、TaqDNA聚合酶1μl、模板6μL、川水至总体积为100μL，瞬时离心,将反应管置于PCR扩增仪，反成条件：95℃预变性4min;95℃「min,55℃1mim.72℃】min，打增35个循坏：72C延伸10min,最后1保存，8.2.4琼脂糖电泳
用1×电泳缓冲液（见B.7)配制1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5ug/mLEB，见B.8，或其他经过验证的等效染色试剂）。将5ulL样品和1uI.6×上样缓冲液（见1B.9)混匀后川人样品孔进行电泳，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像仪「观察。8.2.5设立对照
8.2.5.1实验过程中成设立阳性对照、阴性对照和空户对照8.2.5.2取含有己知蚌病毒参考株的细胞志液或己知感染蚌病毒的组织作为阳性对照，8.2.5.3取正常的细胞悬液或阴性组织作为阴性对照。8.2.5.4取等休积的水代替模板作为空白对照。8.2.6结果判定
PR产物电冰后，阳性对照会出现585bp的DVA片段，所性对照和空门对照均没有该核酸带，
8.2.6.2待测样品PCR扩增后，在585bp的位置1.有条带者，切胶后进行测序。8.2.6.3将测序获得序列（参见附录C）与已知的蛙病再MCP基因序列近行比对·如果与具同源性最近的序列属于病毒属病毒，可判定为蚌病毒阳性；否则，判定为蚌病毒阴性：8.3ELISA检测
8.3.1试验步骤
8.3.1.1用pII9.6的包被被（见B.10)按说明书稀释纯化的病寺单克降抗体，包被ELISA板，每孔100uL，4℃孵过夜，
8.3.1.2 用含 0.05% Twccn-20的0.0l mol/1. P13S(P[3ST,见 B3.12)洗3次。8.3.1.3用1%明胶(PBST配制)(200mL/孔)封闭,37℃孵育1h.PBST洗3次。8.3.1.4加入2倍或4倍系列稀释的待测样品或者病毒培养液，哇病毒参考株（阳性刘照），正常组织样品（阴性对照）和细胞境养液（穿门对照），各2孔，每孔100L，37C孵价1h：PBST洗3次8.3.1.5将山羊抗蚌病毒血清用细胞培养液稀释到T作浓度,每孔川100μL,37C孵介1h，PBST洗3次。
8.3.1.6加人0.1%H,0,（用双蒸水稀释），每孔150μL,37℃孵育15min.PBST洗2次。8.3.1.7将辣根过氧化物酶标记的免抗羊IgG（酶标二抗)用细胞培养液稀释到工作浓度，每孔100μL，37℃孵价1h：PBST洗3次
8.3.1.8川人底物（见B.15），每孔100μL，37℃.避光反应10min~30min，当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加人终止液每孔150ul.，用酶标仪测量各孔在150nm波长时的光密度值（0D4s值）。
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8.3.2结果判定
GB/T39920—2021
以空白对照的（OD），值为零点，先计算阳性对照和阴性对照的（）：值之比。如果阳性对照孔的D值（P）与阴性对照孔的OD值（N)之比人于或等于2.1（即P/N2.1），表明对照成立。再计算待测样品孔与阴性对照孔的(O)D)值之比：当样品孔的OD值（P)与阴性对照孔OD值（N)之比大于或等于2.1（即P/N2.1)时.判为阳性综合判定
采用PCR或ELISA方法，从动物组织或其细胞培养物中检测蛙病.结果为阳性，可判定为蛙病毒感染。
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A.1病原
附录A
(资料性附录）
蛙病毒感染概述
\蛙病毒感染\中的蛙病毒是指虹彩病毒科（Iridouiridue)蛙病声属（Ranuuirus）中感染两栖类动物的成员。蛙病毒是大型的双链DVA病毒.病声粒子占径为150nm~170nm，二十面体对称，基因组大小为105kb~140kb
A.2症状与流行
两栖类动物感染蛙病毒后的症状表现为：慢性溃疡综合征和急性出血综合征，忠病幼体的足底表而皮下组织、腹股沟处以及腹部出现小而积的多灶性出血，伴有腹部水肿，在皮肤上可能形成苍户病灶。不同物种、不同生长阶段和疾病的严重程度导致不同的行为变化，主要包括脊柱前凸、游动异常、嗜睡和平衡失调。两栖类所有成员均易感，白然条件下蛙病毒主要感染有尾凡和无尾几的人多数成员。蛙病感染川通过动物问相接触、食人感染、濒死和死亡个体而传播，也可通过水源及其他途径逊行传播，包括活鱼运输或鱼饵等，流行范围广泛：20世纪60年代，首次在牛蛙（Ranacatesheima）蝌蚪期分离到蚌病毒，随后大量蚌病毒从暴发性疾病巾被分离出。据报道，自1991年开始.己有约80种蛙病毒感染两栖类和爬行类动物并致病·鞋病毒感染是导致两栖类动物人量死亡的重要原因，A.3诊断
两栖类动物突发大量死亡，并伴有皮肤溃疡和/或远端肢体坏死等慢性病症状.初步提示有蚌病毒感染，用病毒分离、PCR或EIISA方法检测确诊6
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B.1细胞培养液
附录B
（规范性附录）
试剂配方
GB/T39920—2021
使用M199培养基（含Earlc=盐），接说明15的要求，用一级水配制，然后加人10%经56℃30min灭活的胎牛而清，用NaHC0，粉末调节培不液的pH为7.2-7.4，过滤除菌，分装后一20保存，在开放系统使用时，如96孔细胞培养板，需要加人过滤除菌的HEPES，使H在培养液中的终浓度为0.02 mol/1.s
B.2细胞消化液（EDTA0.02%、胰酶0.06%的PBS缓冲液）Nacl
Na.HPO1·12H.0
加人NaHCO（人约0.1g-0.6g）),调节pH至7.8.0(pH7.1时EDTA难溶）.充分搅拌直至无不溶物为止，过滤除菌，分装后一20℃保存。B.3CTAB溶液
充分混勾后,用浓HC(约 0.25mI.-~0.3mI.)调节pH至7.5-~8.0.加人2g（TAB,完全溶解后定容至100mL：使用前加基乙醇至终浓度为0.25%。B.4抽提液 I
1mol/LTris饱和氯仿：异戊醇=25：24：1混合，密闭避光保存。B.5抽提液Ⅱ
将氯仿和异戊醇按24：1的比例混合，密闭避光保存，50×电泳缓冲液
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GB/T 39920—2021
Na. EDTA · 2H,O
加人约800ml.水，充分搅拌溶解冰乙酸
加水定容至
室温些存。
1×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容至
究温贮存。
溴化乙锭（FB）
1000 mL
1000ml
用水配制成10mg/mL的浓缩液：用时每10mL电泳液或琼脂中加1uLB.9
6×上样缓冲液
加水溶解，定容至
溴酚蓝
溶解后.4℃保存。
包被液（pH9.6）
充分搅拌溶解后.4℃保存。
100 mL
1000 ml
磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS.pH7.4）NaCl
充分搅拌溶解后，4℃保存。
洗涤液PBST
0.01mo1/l.P13S缓冲液
Tween-20
1 000 ml.
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