GB/Z 39262-2020.Nanotechnologies-Guidance on toxicological screening methods for nanomaterials.
1范围
GB/Z 39262给出了适合纳米材料的体外、体内毒理学和生态毒理筛选试验的方法。这些方法有助于纳米材料毒理学包括生态毒理学的筛选。本指导性技术文件的毒理学筛选试验可用于研究和产品研发的早期判定,对其潜在毒理学/安全性风险做出快速反馈,或者进行初步的评价。本指导性技术文件可分为与人类健康相关的和与环境相关的毒理学筛选方法。筛选试验是指相对简单和廉价的方法,容易进行且可提供纳米材料对人类和环境是否具有潜在负效应的相应指征。
GB/Z 39262重点描述适用于毒理学评价的初步筛选方法,是其他国外标准的补充，与其他国际组织如OECD的相关文件并不重复。如果筛选结果提示了危害的早期指征,本指导性技术文件将引导测试者参考其他组织的文件进行全面毒理学评价或进一步的全面研究。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T32269-2015纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片(ISO/TS27687 :2008, IDT)
ISO/TS 80004-1纳米科技术语第1部分:核心术语(Nanotechnologies-Vocabulary-Part1: Core terms)

ICS07.030
中华人民共和国国家标准化指导性技术文件GB/Z39262--2020/ISO/TR16197:2014纳米技术
纳米材料毒理学筛选方法指南
NanotechnologiesGuidance on toxicological screeningmethodsfornanomaterials
(ISO/TR16197:2014,Nanotechnologies-Complicationanddescriptionoftoxicological screeningmethodsformanufacturednanomaterials,IDTy2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-06-01实施
GB/Z39262—2020/ISO/TR16197:2014前言
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
毒理学筛选对于人造纳米材料安全性评价中的作用和关联性5.1
5.2毒理学筛选是人造纳米材料毒理评估方法的一部分5.3毒理学筛选的相关剂量讨论
5.4与ISO/TR16196关系
5.5与ISO/TR13014关系
5.6其他有关国际活动和出版文献综述6人类健康相关的毒理学筛选方法6.1概述
6.2阳性和阴性对照
6.3体外毒理学筛选方法
6.4纳米材料体内毒理学筛选方法…7环境相关的毒理学筛选
7.1概述·
7.2环境归宿和分布.
7.3环境降解和转化
7.4环境生物残留和蓄积
参考文献
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GB/Z39262—2020/IS0/TR16197:2014本指导性技术文件按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本指导性技术文件使用翻译法等同采用ISO/TR16197：2014《纳米技术制造纳米材料毒理学筛
选方法的编制和描述》。
与本指导性技术文件中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：第1部分：核心术语（ISO/TS80004-1：2010，IDT）GB/T30544.1一2014纳米科技术语本指导性技术文件做了下列编辑性修改：将标准名称修改为“纳米技术纳米材料毒理学筛选方法指南”；参考文献重新排序。
本指导性技术文件由中国科学院提出。本指导性技术文件由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。本指导性技术文件起草单位：中国医学科学院基础医学研究所、北京大学。本指导性技术文件主要起草人：许海燕、孟洁、贾光、陈章健、温涛、赵琳。I
rrKaeerkca-
GB/Z39262—2020/ISO/TR16197.2014引言
本指导性技术文件给出了对纳米材料进行毒理学筛选的方法通则，这些方法适合在开展纳米材料的全面毒理学测试、分析和风险评估之前应用毒理学筛选方法聚焦于提供可用于决策过程的信息和工具。例如，本指导性技术文件给出了筛选方法的信息，这些方法可用于筛选纳米材料，以决定是否继续研发该纳来材料或者含有该纳来材料的产品，是否投人大量费用开展全面毒理学测试，或决定在继续进行纳米材料研究之前是否设置了合适的对照。本指导性技术文件及所提供的一系列有效的测试方法与现行的针对纳米材料测试、利用和废弃处理的监管要求之间没有冲突或/和竞争关系。本指导性技术文件所提供的信息与其他国际标准相符。例如，ISO/TR16196：2016讨论在不同介质中准备毒理学测试样品的方法；ISO10993-18专门强调，要对医疗器械中材料的化学特征进行评价：ISO14971指出，毒理学风险分析要考虑材料的化学性质：ISO/TR13014论述了材料本身的属性；ISO/TR13121描述了区分，评价和报告纳米材料潜在风险的过程，并提供了分层纳米材料毒性测试指南。
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1范围
纳米技术
GB/Z39262—2020/IS0/TR16197:2014纳米材料毒理学筛选方法指南
本指导性技术文件给出了适合纳米材料的体外、体内毒理学和生态毒理筛选试验的方法。这些方法有助于纳米材料毒理学包括生态毒理学的筛选。本指导性技术文件的毒理学筛选试验可用于研究和产品研发的早期判定，对其潜在毒理学/安全性风险做出快速反馈，或者进行初步的评价。本指导性技术文件可分为与人类健康相关的和与环境相关的毒理学筛选方法。筛选试验是指相对简单和廉价的方法，容易进行且可提供纳米材料对人类和环境是否具有潜在负效应的相应指征。本指导性技术文件重点描述适用于毒理学评价的初步筛选方法，是其他国外标准的补充，与其他国际组织如OECD的相关文件并不重复。如果筛选结果提示了危害的早期指征，本指导性技术文件将引导测试者参考其他组织的文件进行全面毒理学评价或进一步的全面研究。2规范性引用文件
下列文件对手本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T32269-2015纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片（ISO/TS27687:2008,IDT)
ISO/TS80004-1纳米科技术语第1部分：核心术语（Nanotechnologies—Vocabulary—Part1:Coreterms)
3术语和定义
GB/T32269—2015和ISO/TS80004-1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
团聚体agglomerate
弱束缚颗粒的堆积体、聚集体或二者的混合体，其外表面积与其单个颗粒的表面积的总和相近。注1：支辉团聚体的作用力都是弱力，如范德华力或简单的物理缠结，注2：团聚体也被称为次级颗粒，而源颗粒则被称为初级颗粒，[GB/T32269—2015，定义3.2]
聚集体
aggregate
强束缚或融合在一起的颗粒构成的新颗粒，其外表面积可能显看小于其单个颗粒表面积的总和。注1：支举案集体的力都是强作用力，如共价键或源于烧结或复杂的物理缠结注2；聚集体也被称为次级颗粒，面源颗粒则被称为初级颗粒。［GB/T322692015，定义3.3
rKaeerkAca-
GB/Z39262—2020/ISO/TR16197.20143.3wwW.bzxz.Net
人造纳米材料manufacturednanomaterial为了商业目的而制造的具有特定功能或特定组成的纳米材料。[ISO/TS80004-1.定义2.9]
纳米纤维
nanofibre
两个维度外部尺寸相近且处于纳米尺度，剩余一个维度外部尺寸明显大于其他两个维度尺寸的纳米物体。
注1：纳米纤维可以是柔性的，也可以是刷性的，注2：对尺寸相近的两个维度，其外部尺寸差异宜小于3倍，而最长的外部尺寸宜比其他两个尺寸大3倍以上，注3：最长的外部尺寸可不在纳米尺度，[GB/T32269—2015，定义4.3]
纳米材料
nanomaterial
任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度的材料。注1：本通用术语包括纳米物体和纳米结构材料，注2：见工程化纳米材料，人造纳米材料和伴生结米材料。[ISO/TS80004-1定义2.4]
纳米物体
nano-object
一维、二维或三维外部尺寸处于纳米尺度的物体。注：用于所有分立的纳米尺度物体的通用术语。［GB/T322692015，定义2.2
纳米颗粒
nanoparticle
三个维度的外部尺寸都在纳米尺度的纳米物体。注：如果纳米物体最长轴和最短轴的长度差别显著（大于3)时，则要用纳米棒和纳米片来表示纳米颗粒。［GB/T322692015，定义4.1]
纳米尺度
nanoscale
处于1nm至100nm之间的尺寸范围。注1：本尺寸范围通常、但非专有地表现出不能由较大尺寸外推得到的特性，对于这些特性来说，尺度上、下限值是近似的。
注2：引人下限（约1nm）的目的是为了避免将单个原子或原子团族认为是纳米物体或纳米结构单元。[GB/T32269—2015，定义2.1]
纳米管
nanotube
中空纳米纤维。
［GB/T32269—2015，定义4.4]
颗粒particle
具有确定物理边界的一小部分物质。注1：一个边界也可以看成一个界面。2
rKaeerkca-
注2：一个题粒可以作为一个整体移动。注3：该通用颗粒定义适用于纳米物体。[GB/T32269—2015，定义3.1]
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GB/Z39262—2020/ISO/TR16197.2014ASTM：美国测试和材料学会（AmericanSocietyforTestingandMaterials）ESR：电子自旋共振（ElectronSpinResonance）IT：气管内（Intracheal)
ITS：整合测试策略（某些情况下也称为智能测试策略）[IntegratedTestingStrategies（orinsomecases,IntelligentTesting Strategies)]LTE淋巴组织等同模块（LymphoidTissueEquivalentModule）NMs：纳米材料(Nanomaterials)OECD：国际经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment）PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）PTE：外周组织等同物（PeripheralTissueEquivalent）ROS：活性氧物种（ReactiveOxygenSpecies）STS：标准毒性研究（StandardToxicityStudies）5总论
5.1毒理学筛选对于人造纳米材料安全性评价中的作用和关联性及时了解不断涌现的纳米材料（NMs）的新特性，并在暴露于人体之前对其进行全面的毒理学评价是一个挑战。纳米材料的暴露主要包括职业暴露和环境暴露。理论上讲，元素周期表中的每一种元素都可以制备成纳米材料。纳米材料的多样性使其难以被现有的毒理学试验方法评价每种新型纳米材料，因此，使用高通量的毒理学筛选方法十分必要，有望使毒理学分析跟上当前市场上纳米材料的通现速度。考患到测试成本、结构和时间等条件的限制，筛选主要以细胞培养及其他体外实验方法进行，这样可以尽量减少动物实验。此外，根据3R原则［替代、减少、优化（replacement，reduction，refine-ment)丁zi，世界各国和相关研究机构与组织都在努力减少动物体内实验研究的数量。筛选试验的目的是提供毒理学基本信息，提示纳米材料是否对人类健康或者环境具有潜在的负面作用。尽管对于“筛选试验”这一术语有很多定义，根据本指导性技术文件的目的，筛选试验定义为相对简单和廉价，易于进行并可以快速得到结果的试验。筛选试验包括以下（原则）：
一不使用（或非常有限数量的）有知觉动物；一能获得可定量的终点结果，或者得到被广泛接受和可靠的是/否结果；一在多个实验室证明具有可重复性；阳性和阴性对照实验可重复。
筛选试验还可以提供专门的机理数据，这些数据既可以用于确定纳来材料的负效应通路框架，也可以用于材料的化学指纹特性分析。本指导性技术文件仅涉及可用于纳米材料毒性评价的筛选试验，所得到的结果可用于确定某种纳米材料产品是否需继续研发，例如，终止那些被预测有害的纳米材料的研发。
当用于分层试验策略时，高通量筛选方法可以避免进一步的体内试验，或确认某些纳来材料的毒3
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GB/Z39262-—2020/IS0/TR16197.2014性，将其作为体外或者体内研究的靶点，这样可以高效确定纳米材料的毒性。由于大量具有复杂理化性质的纳米材料已经进人市场，面且还在不断研发，因此，以高通量方式进行的筛选对保护人类健康具有重要的意义。
相比于详细和确认性的检测方法，筛选方法有局限性。因此，对筛选方法的设计需要考虑到使其可以嵌入到整合的试验策略中。筛选方法的局限性包括以下方面：筛选方法难以对人体反应做出预测；一将筛选方法的结果外推至人体暴露的量效关系是很复杂的；一从急性暴露的筛选结果难以预测人体慢性暴露的危害。虽然一般不能将筛选试验作为唯一的方法，但如果筛选试验结果提示某种纳米材料具有确切的毒性或者无毒性，则没有进一步研究的必要。这意味着在某些情况下，筛选方法无疑会过高或过低评估纳米材料对人类的危害。5.2毒理学筛选是人造纳米材料毒理评估方法的一部分分级试验是以逐级试验为基础，每一级的评价结果都为下一级提供所需要的数据/信息，这些数据/信息可能是后续试验中需要的或将用于全部试验。筛选试验通常包含在分级试验策略中，而且一般在最早期进行，这样可以使不同层次的资源都得到有效利用，例如，根据早期测试的结果，可以判断是否进行下一层次的试验，决定是否继续研发。毒理学筛选是循证权重和ITS中的最初级部分[2]。ITS会综合纳米材料已有的数据，提供合理的试验策略，明确纳米材料的危害，尽量避免不必要的动物实验。除了体外和体内方法，计算机模拟也是ITS的一部分。从原理上讲，定量结构-活性关系（Quanti-tativeStructure-ActivityRelationship，QSAR)分析方法可应用于纳米颗粒，将纳米材料的结构和理化特性与其生物活性关联起来-24，建立定性（如氧化应激潜能）或定量（如细胞毒性倾向）的预测模型，模型依赖于数据和建模的方法。由于缺少合适的数据集，迄今只有少量的研究结果发表L25-3]。关于纳米材料QSARs的发展和面临的挑战将在其他部分重点阐述4-35)。5.3毒理学筛选的相关剂量讨论
纳米材料可通过不同途径暴露于人体和环境，例如，通过呼吸道、消化道和皮肤暴露于人体；对于环境来说，主要包括水、空气和土壤暴露。某些途径的暴露浓度是可以确定的，比如工作场所空气中的纳米颗粒，或暴露于皮肤的每克水包油乳液中的纳米颗粒。目前，环境中纳米材料的暴露浓度是未知的。对于定量的风险评估来说，需要确定暴露浓度；但是在筛选水平上，暴露浓度的确定并不是必需的。在所有研究中，进行筛选试验的研究人员和数据分析人员都要避免过度解读纳米材料的量效关系。尽量选择使用与纳米材料实际暴露相近的剂量来进行研究。因此，呼吸道相关的细胞试验要与纳米材料吸入后肺内累积浓度相当；而体外表皮细胞试验则要采用与皮肤接触的纳米材料浓度相当的剂量水平。其他剂量可以用于阐述剂量依赖响应性。为了判断纳米材料是否具有潜在毒性，通常要研究剂量-效应关系。在这种研究中，最低剂量一定要在预期的人类暴露剂量范围内，高剂量通常要超出实际的暴露剂量，用来刺激被检测系统，从而判断纳米材料的潜在毒性。在准备测试样品过程中需要考虑很多因素，以保证靶剂量得以实施，除在评价中考虑了纳米颗粒团聚的影响外，尽量使用分散剂以保证纳来颗粒不形成团聚体。如果使用了分散剂，需要评价这些分散剂是否对所研究的纳米颗粒的效应产生影响。例如，如果评价纳米颗粒的毒性，该分散剂一定不能具有毒性效应。一些利用高能量的方法，如超声，可以辅助分散纳米颗粒。但是，需要注意的是这样分散处理得到的颗粒是否能够代表其在环境中的状态。正如本指导性技术文件在几处所提到的，要充分收集纳米材料的理化信息，使研究者能够考虑文献中的若干剂量指标（数目、质量和表面积）。在环境爆露中，需要区分环境浓度、暴露方式和剂量。尤其4
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GB/Z39262—2020/ISO/TR16197.2014要注意的是，如果纳米材料稳定分散的时间比测试时间短，就要考虑其他的剂量表示方法。根据其特性，筛选试验主要用于确定危害和寻找剂量范围，为后续更多的精确测试做准备。此处特别需要提醒的是，用于风险评估的剂量水平（环境浓度和暴露程度）与进行危害判定的剂量水平是不同的。
5.4与ISO/TR16196关系
本指导性技术文件的制定与ISO/TR16196：2016互为补充。ISO/TR16196讨论了在不同介质中制备毒理学研究所采用样品的方法，也讨论了在考虑不同暴露途径时，适用于毒理学研究的剂量衡量指标，本指导性技术文件对ISO/TR16196给予了补充，其中不再讨论样品的制备和计量方法，而是更加详细地讨论了进行毒理学筛选的各种方法，使用本指导性技术文件时参考ISO/TR16196，这一点很重要，因为进行纳米材料毒理学评价时，常常会遇到样品制备和剂量方面的问题。5.5与ISO/TR13014关系
ISO/TR13014讨论了纳米材料表征对于纳米材料毒理学测试的重要性，并提供了一份需要测定参数的列表，这些参数是以当前所认知的纳米材料参数与其潜在不良效应的关系为基础来确定的ISO/TR13014推荐对纳米材料进行充分的表征，以更好地理解和解读毒理学试验结果；因此，其是本指导性技术文件很好的背景资料。5.6其他有关国际活动和出版文献综述国际组织OECD和ASTM以及一些国家计量研究院也在努力推动纳米毒理学测试的标准化[36]OECD的人造纳米材料工作组（WorkingPartyonManufacturedNanomaterials，WPMN）成立于2006年，到2011年已经有九个指导组（SG)，如表1所示。表1
OECD纳米材料工作组的指导组
指导组
SG1/SG2
指导组名称
OECD纳米材料数据库，用于收集信息和分析环境健康与安全（EHS)研究活动典型纳米材料的安全性试验
纳米材料和试验指南
志愿项目与监管程序的合作
风险评估合作
纳米毒理学替代方法的作用
暴露测量和暴露减轻
纳米材料的环境可持续应用
WPMNSG4对于将OECD的测试指南应用于纳米材料做了全面综述。原则上现有OECD试验方法都可以用于纳米材料。关于纳米材料安全性试验和风险评估中的样品制备与剂量表示方法的指南已于2012年出版【3)。
2011年，欧洲食品管理署（EuropeanFoodSafetyAuthority，EFSA）出版了关于食品和伺料中使用工程纳米材料（engineerednanomaterial，ENM)的风险评估指南文件。该指南涵盖了食品和饲料中使用纳米颗粒的风险评估，包括食品添加剂、酶、香料、食品接触材料、新型食品、饲料添加剂、和杀虫剂（相关链接：http：//esfa.europa.eu/eu/efsakournal/pub/214o.htm)。2o12年，欧盟消费者安全科学委员会（EuropeanCommissionsScientificCommitteeonConsumer5
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GB/Z39262—2020/ISO/TR16197.2014Safety，SCCS）发布了关于化妆品中纳米颗粒的安全性评价指南（相关链接：http：//ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety/docs/sccs_s_o05.pdf),ASTM国际组织技术委员会纳米技术分会（E56)已经制定和颁布了三份关于纳米材料毒理学试验的标准（见表2)。
表2ASTME56发布的关于毒理学测试标准文献号
E2524-08
E2525-08
E2526-08
纳米颗粒溶血性的标准试验方法评价纳米颗粒性材料对小鼠粒-巨噬细胞克隆形成效应的标准试验方法在猪肾细胞和人肝癌细胞模型上评价纳米颗粒材料细胞毒性的标准试验方法近期，关于纳米颗粒对健康、安全和环境影响的数据库已经在欧盟第七框架的支持下建立起来（链接：nhecd-fp7.eu)。这一数据库可自动更新，用户也可对其进行评价。6人类健康相关的毒理学筛选方法6.1概述
体外筛选方法既可以在细胞上进行，也可以采用非细胞方法。非细胞方法可检测纳来材料的非特异效应，如纳米材料在细胞培养基中或血浆中与蛋白分子相互作用，或产生自由基的潜能。基于细胞方法可以用来检测纳米材料对生命过程的干扰情况，特别是对维持细胞稳态的过程的影响。这些过程包括细胞存活、增殖、DNA复制和细胞分化等。体外筛选方法已经成功用于测定纳米材料的有害效应，如DNA损伤、基因变异、细胞凋亡或坏死。单独的、基于终点判定的体外试验难以预测纳米材料的整体动物体内效应，但是一系列的体外试验结果可预测体内效应（例如：器官特异性功能影响、组织特异性通路和过程）。美国国家研究委员会提出的“21世纪毒性测试”中，高通量体外筛选试验是其中组成部分[38]。在分级试验策略中，筛选方法可以作为第一级，用于纳米材料的毒性判断和预警；可以根据监管体系或应用的要求，开展进一步的系列验证实验。替代性筛选技术也可以整合到分级试验体系中。这些技术包括高通量但中等输出的平台，例如基因组学，蛋白质组学和代谢组学。这些技术通过一个实验就可以提供纳米材料暴露可能影响的所有生物过程信息，如果可能，建议开展多种筛选试验，以避免假阳性或假阴性的结果。6.2阳性和阴性对照
为了使获得的结果更有意义，筛选试验要设置阳性和阴性对照，一般来说，阳性对照用于确认试验过程。阳性对照从以往经验中确定，是在已知暴露条件下引起不良反应的物质。合适的阳性对照与纳米材料具有共同的理化特性，至少是某一类典型的纳米材料，例如金属氧化物、金属、高分子等。通过阳性对照的设置，可以为未知毒性的纳米材料提供一个参考基准，该阳性对照的毒性是经过充分表征的，生物机制最好也是明确的。此外，阳性对照的剂量范围要能与真实环境中的暴露条件相对应。在气管滴注毒理学研究中，由于二氧化硅晶体（nanoUsil)会在体内引起炎症反应，已经被用作阳性对照样品。类似的，石棉纤维也可以用作体内和体外纤维毒理学研究的阳性对照样品，在设计筛选试验时，尽量考虑使用合适的阳性对照颗粒和纤维。另一方面，阴性对照是没有引起毒性效应的样品，或仅引起很低的效应，可以作为背景水平来处理。如果阴性对照样品引起了阳性效应，通常意味着某些其他因素影响了试验，这样的测试结果要舍弃，目前的毒理学筛选方法是针对化学物质和宏观尺度颗粒物建立的，因此，对照物主要是化学物质或者宏观尺度颗粒物。当纳米颗粒毒理学筛选方法发展起来之后，基于纳米材料的对照样品将逐步替代6
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GB/Z39262-2020/1S0/TR16197:2014传统测试的对照样品。纳米颗粒参考物质的出现将有利于建立纳米毒理学试验框架，加速筛选试验流程，减少不同实验室之间测试结果的不一致。近来，典型测试材料（RepresentativeTestMaterial，RTM)这个术语被引人用于表示表征充分的纳米材料，研究者可以从欧盟联合研究中心纳米材料资源库中获得这些纳米材料，这个资源库设在意大利伊斯普拉。这些纳米材料已经被广泛应用，有大量的基本信息可以获取。
6.3体外毒理学筛选方法
6.3.1概述
建立体外筛选体系的第一步是判定哪些体外检测方法适合引人。总体来说，用于测试纳米材料的体外检测方法包含有阳性和阴性对照，以及保证检测质量的条件。理想的阳性对照是可能对人体造成危害的纳米颗粒，这个方法可用于评价阳性对照的毒理作用机制：阴性对照则与危害无关。如果没有合适的纳米题粒作为对照样品，可以使用小分子作为对照样品，筛选方法还包含判定排除纳米颗粒干扰的方法，因为有很多关于纳米颗粒的光谱、催化或者吸附性质对测试会有干扰的事例实例（40-42]。此外，为了全面判定可能的假阳性和假阴性结果，有必要使用多种方法检测同一机制。理想的情况下，除了局部效应之外，引人到纳米材料毒性筛选体系的体外检测方法要能够预测纳来材料对人体的危害；而检测方法要有合适的纳米材料作为阳性对照。这些体外方法是否可以使用，以及最终是否可以将阳性材料纳人更高层的生物测试方法，取决于其预测能力。近期的研究数据提示，将体外氧化应激响应与表面积剂量转换相结合，在预测急性肺部炎症方面具有应用前景()。很多体外试验的结果已经可以预测人体的反应，因此，鼓励研究人员使用（或进一步研发）那些经过仔细控制和充分设计，能够预测人体健康效应的体外试验方法349。但是，在某些情况下，观察到的毒性是由其他机制所产生的，而不是被检测的机制，或者体外试验方法本身没有准确地检测这些机制的靶标。这是使用体外试验方法来筛选纳米材料毒性所存在的主要问题。对于一些试验方法（如细胞毒性、基因毒性），需要首先确定细胞对纳米材料的摄取和接触，如果细胞没有摄取纳米颗粒，细胞器没有暴露于纳米颗粒，可能不会产生后续生物效应。
与小分子毒理学相比，人造纳来材料的毒理学仍然是非常年轻的学科：即使对小分子来说，研发出一系列既具有预测性也具有排除性的体外检测方法也面临着挑战，目前尚不完善S，将已知有毒物质划分到现有类别中，可能更容易判定出合适的方法：小分子毒物类别，如内分泌于扰物，与确定的毒性、作用机理、结构-活性关系相关，而且，对于体外筛选最重要的是已经得到验证的体外方法。对于纳米材料毒理学也是一样，需要基于理化特性将纳米材料进行分类，明确其毒性和作用机理。作为一门科学，纳米材料毒理学还没有达到成熟的水平。与纳米材料类似，在许多情况下，小分子毒理学的机制基础也不清楚。在这种情况下，一些项目，如美国环境保护署（EnvironmentalProtectionAgency，EPA)的ToxCast，正使用大量已知毒物的生物活性谱体外检测矩阵来判定和预测新化合物毒性的特征指纹[50]，已知的纳米材料毒物的矩阵谱也可用于确定纳米材料毒性特征指纹，其中涉及众多生物检测方法，在预测纳米材料毒性方面具有应用前景。氧化应激介导的炎症及其机制在纳米毒理学中已经被充分研究[51-52]。但是，这套方法几乎完全由研究呼吸暴露导致肺毒性的研究人员建立起来，不一定适合纳米材料对其他靶器官的毒性评价及其他暴露途径。这一事实使这些基于氧化应激和炎性检测的筛选方法仅适用于对环境或职业暴露的有害物质做出评价，在这些环境中，呼吸是主要的暴露途径，对于呼吸不是主要暴露途径的其他自的，如生物医学应用，这些方法则可能不合适。例如，对于全身暴露的情况，血液学检测方法更适合引人到筛选试验中[s3]。类似的，筛选局部应用的纳米颗粒时，比如防晒霜，进行皮肤光毒性和屏障功能试验可能更合适。因此，对于使用体外试验作为筛选方法的人来说，理解每一种试验方法的内涵，包括其设定的暴露途径和靶器官，是非常重要的。事实上，随着纳米材料毒理学的发展，新的机制研究方法将被确认和证实，不仅能用于预测特殊暴露途径引起的毒性，而且可用于纳米材料的分类，iiKaeerkAca-
GB/Z39262-—2020/IS0/TR16197.20146.3.2细胞毒性
当使用合适的细胞或细胞系时，细胞毒性试验是最基本的和常见的体外测试方法，可与体内高剂量急性毒性相对应。通常情况下，细胞毒性通过暴露24h后50%的致死浓度（LCs）或50%的有效浓度(ECs。）来评价。由于大部分的细胞毒性实验都是在含有胎牛血清（FBS)的培养基中或在适合细胞生长的条件下进行，细胞数在24h培养过程中可能会增加，因此ECso相比于LCso更合适现在普遍使用的检测化学物质毒性的方法都可以用手检测纳来材料的毒性。便用最多的方法是3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐［3-（4，5-Dimethy）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，MTT法或改良的MTT法。阿尔玛蓝（Alamarblue）、乳酸脱氢酶（LDH）释放和台盼兰染色细胞计数的方法也经常使用。在细胞毒性检测中，样品中不透光的纳米材料可能会影响显色或荧光数值。这个问题可以通过在测试前将上清液小心地转移到另外的板孔或比色池中来解决。但是，也要研究被测纳米材料对测试体系终产物的吸附或者对荧光或紫外可见光的干扰。如果确定存在这样的吸附或干扰，那么这些试验可能无法得到有关纳米材料毒性的可信结果。对这样的干扰，有必要在测试中加人合理的对照。
当检测疏水性纳米材料的毒性时，被测材料的分散性是决定性因素之一，因为疏水性纳米材料的团聚体可能无法到达细胞层。需要注意的是，纳来材料最重要的性质，表面电势的极性，决定细胞对纳米材料的摄取。使用添加剂或表面涂层可以改变纳米材料的表面电势[54]。因此，在毒性测试之前，优先检测细胞对纳米材料的摄取。6.3.3炎性和免疫反应
与传统的药理和化学免疫毒性测试相比，纳米材料的免疫毒性评价可能面临更多的挑战。与非纳米材料相比，纳米材料具有不同的理化性质。源于纳米尺度的理化性质可能是纳米材料免疫毒性评价需要考虑的重要因素。纳米颗粒的尺寸和分布以及表面积是决定其对环境、健康及安全影响的重要决定因素。材料的毒性具有尺寸依赖性，并与其表面积相关[5-57]。化学反应通常在材料表面发生，因此，对相同的材料来讲，比表面积大的材料其化学活性也相对较高。纳米材料的聚集体/团聚体可能会影响肺泡巨噬细胞对颗粒的消化。吸入到肺内的颗粒通常被巨噬细胞识别和清除。一些研究发现，与单个纳米颗粒相比，纳米材料聚集体或团聚体更容易被巨噬细胞识别，以更快的速度被清除。纳米颗粒的形状对其毒性的影响目前还没有被充分研究，有文献指出，高长径比的纳米纤维（HARN)在动物体内可能会引起与石棉类似的反应[]。有综述论文对纳米材料在动物体内的免疫毒性进行了全面总结]。皮肤致敏实验（迟发型超敏反应）有三种体内测试方法，包括豚鼠最大剂量法致敏试验（GPMT）、豚鼠局部封闭涂皮试验（BT)和局部淋巴结试验（LLNA)CIo)，后两种测试依赖于致敏前测试样的透皮性能。但是，纳米材料通常被认为透皮性能较低或不能透过皮肤[0-3]。目前正在研发针对化学品的体外替代测试，这些替代方法是否可用于纳来材料还未知。体外免疫模式系统提供了一系列明确和标准检测免疫毒性的方法。该系统是一套专利技术，用人的细胞来模仿人体的免疫系统，在体外进行培养和检测。该系统由模块组成，包括PTE模块、LTE模块，功能测试及附加的疾病模型模块。PTE的工作方式与周围组织，如皮肤、肺、和附加黏膜组织中的固有免疫和获得性免疫反应类似。PTE能够预测佐剂或疫苗的效能、毒性、及多种生物的和化学的化合物的免疫刺激潜能。针对皮下或肌肉暴露、静脉暴露和黏膜组织也有专门的模型，
LTE模块使用适当的细胞类型及其相互作用来模拟淋巴结中树突细胞活化T细胞，进而使B细胞活化并产生抗体的过程。工TE模块可以产生活化的T细胞、抗体和细胞因子，比使用外周单核细胞8
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