GB/T 19167-2020.Diagnostic techniques for infectious bursal disease.
1范围
GB/T 19167规定了传染性法氏囊病临床诊断和实验室诊断的技术要求。
GB/T 19167适用于鸡传染性法氏囊病的诊断、检测、监测和流行病学调查。其中琼脂凝胶免疫扩散试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(实时荧光RT-PCR)、病毒分离等诊断方法适用于临床疑似样本的检测与病毒分离,琼脂凝胶免疫扩散试验方法还适用于免疫抗体水平检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求.
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AGID:琼脂凝胶免疫扩散试验(Agar gel immunodiffusion test)
CEF :鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast cell)
CPE:细胞病变(Cytopathic effect)
IBD:传染性法氏囊病(Infectious bursal disease)
IBDV:传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus)
PBS:磷酸盐缓冲液( Phosphate buffered saline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
RT-PCR :反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)
Real-time RT-PCR:实时荧光反转录聚合酶链式反应( Real-time reverse transcription- polymerase chain reaction)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T19167—2020
代替GB/T19167—2003
传染性法氏囊病诊断技术
Diagnostic techniques for infectious bursal disease2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T19167—2020
本标准代替GB/T19167—2003《传染性囊病诊断技术》，与GB/T19167—2003相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：
将“传染性囊病”和“传染性法氏囊病”统一为“传染性法氏囊病”；一增加了规范性引用文件（见第2章）；增加了缩略语（见第3章）；
增加了器材和试剂（见第5章、第6章、第7章、第8章、第9章）；增加了临床诊断（见第4章）；
增加了实验室诊断样品采集（见第5章）；删除了直接免疫荧光法（见2003年版的2.5.2）；删除了酶联免疫吸附试验（见2003年版的第5章）；增加了RT-PCR检测方法（见第7章、附录C、附录D)；增加了实时荧光RT-PCR检测方法（见第8章、附录E）；删除了血清抗体的检测（见2003年版的第4章）；增加了细胞培养分离病毒检测方法（见9.4.1、附录F）：增加了诊断结果的综合判定（见第10章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
本标准主要起草人：蒋文明、陈继明、刘月焕、王笑梅、王静静、刘爵、高玉龙、李阳、于晓慧、刘朔、庄青叶、李金平、侯广宇、祁小乐、王素春、刘华雷。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T19167—2003。
GB/T19167—2020
传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease，IBD）又称甘布罗病（Gumborodisease），由双股RNA病毒科（Birnaviridae）禽双股RNA病毒属（Avibirnavirus）传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起。火鸡、鸭、珍珠鸡和驼鸟均可感染IBDV。3周龄～6周龄的鸡发病急而且重，病死率高，而1周龄～3周龄鸡常呈现亚急性或亚临床症状。该病毒侵害法氏囊可引起严重免疫抑制。已知IBDV有两个血清型，即血清1型和2型，仅1型对鸡有致病性，火鸡和鸭为亚临床感染，2型未发现有致病性。本病具有特征性临床症状和眼观病变，可做出初步诊断，确诊应进行病原检测2003年之后，国内外IBD诊断技术发展快速。一些更为简便和准确的诊断新技术已经成为IBD诊断和预防的重要手段。本次对IBD诊断技术的修订，目的有二：一是与国际标准基本保持一致，改变国家标准显著滞后于国际标准的状况；二是将一些在国内外经过多年实践证明成熟可行的新技术纳入进来，改变原有标准中检测技术偏少且显著滞后于实际应用的状况。修订此标准，有利于我国IBD诊断和预防，也有利于提升国家标准的权威性和实用性本标准参考OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2016版），并结合我国相关技术研究新成果进行修订。
1范围
传染性法氏囊病诊断技术
本标准规定了传染性法氏囊病临床诊断和实验室诊断的技术要求GB/T19167—2020
本标准适用于鸡传染性法氏囊病的诊断、检测、监测和流行病学调查。其中琼脂凝胶免疫扩散试验、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（实时荧光RT-PCR）、病毒分离等诊断方法适用于临床疑似样本的检测与病毒分离，琼脂凝胶免疫扩散试验方法还适用于免疫抗体水平检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验（Agargelimmunodiffusiontest）CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickembryofibroblastcell)）CPE：细胞病变（Cytopathiceffect）IBD：传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease）IBDV：传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Real-timeRT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timereversetranscription-polymerasechain reaction)
SPF：无特定病原体（Specificpathogenfree）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethylaminomethane-aceticacidethylene diaminetetra acetic acid4临床诊断
4.1流行病学
4.1.1自然感染仅发生于鸡，各种品种的鸡都能感染。4.1.2主要发生于2周龄～15周龄的鸡，3周龄~6周龄的鸡最易感，而1周龄～3周龄鸡常呈现亚急性或亚临床症状
4.1.3常呈急性发病，传播迅速，通常在感染后第3天开始死亡，5d～7d达到高峰，后快速下降。SZA
GB/T19167—2020
2临床症状
4.2.1潜伏期为2d~3d。
4.2.2易感鸡群感染后发病突然，病鸡体温突然升高，病鸡出现腹泻，排出白色黏稠或水样稀便，病程般为1周左右，
4.2.3急性病鸡可在出现症状1d～2d后死亡，鸡群3d5d达死亡高峰，以后逐渐减少。4.2.4随着病程的发展，食欲废绝，颈和全身震颤，病鸡步态不稳，羽毛蓬松，精神委顿，卧地不动，呼吸困难，泄殖腔周围的羽毛被粪便污染。4.2.5后期病鸡脱水严重，趾爪干燥，最后衰竭死亡。4.3
剖检变化
严重者腿部和胸部肌肉有条索状或斑块状出血。法氏囊水肿和出血，体积增大，重量增加，严重者呈紫黑色、葡萄状；部分法氏囊出现萎缩。4.3.2
有些法氏囊淡黄色水肿。
肾肿大褪色，肾小管有尿酸盐沉积，呈红白相间“花斑肾”。4.3.4
结果判定
符合上述流行病学特征、临床症状和剖检变化的病例,可以判为疑似IBD。确诊应采集有临床症状动物的法氏囊等组织或血清进行实验室诊断。实验室诊断样品采集
5.1器材
5.1.1手术剪刀和镊子。
离心管。
样品保存管。
组织匀浆器。
采血器。
5.2试剂
0.01mol/LpH7.2PBS.配方见附录A中A.1。5.2.2青霉素。
链霉素。
样品菜集
生物安全措施
按照GB19489的要求进行。
5.3.2组织病料采集
采集多只病鸡的法氏囊，分别装人样品保存管，密封、冷冻保存。5.3.3血清样品采集
经翅静脉采集鸡血液，每只应不少于1mL。无菌分离血清，装入2mL离心管中，密封后2℃～8℃2
冷藏或一20℃冷冻保存。
5.4样品处理
GB/T19167—2020
用剪刀剪碎法氏囊组织.加人含青霉素4000IU/mL和链霉素4000μg/mL的PBS，用组织匀浆器制成20%匀浆，反复冻融2次～3次，10000r/min离心10min，取上清作为检测材料。琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）6
6.1器材
6.1.137℃温箱
6.1.2烧杯（200mL）
6.1.3搅拌棒。
6.1.4电磁炉。
6.1.5微量可调移液器（10uL、100μL、1000μL等不同规格）。灭菌平Ⅲ（9cm～15cm）。
打孔器（中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm）。6.2试剂
标准IBD琼扩阳性抗原（参见附录B的B.1）6.2.2
标准IBD琼扩阴性抗原（参见B.2）。6.2.3标准IBDV阳性血清（参见B.3)。6.2.4标准IBDV阴性血清（参见B.4)。c6.2.5琼脂糖。免费标准下载网bzxz
0.01mmol/L磷酸缓冲液（pH7.4）.配方见A.2。6.2.6
氯化钠。
6.3试验程序
6.3.1琼脂平血制备
参见B.5。
6.3.2打孔、封底
在制备好的琼脂板上用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm，在火焰上封底。
6.3.3加样、孵育、观察
6.3.3.1病原检测
中央孔加入标准IBDV阳性血清，第1孔、第4孔分别加人标准IBD琼扩阳性抗原和标准IBD琼扩阴性抗原，其他孔分别加人待检样品，20μL/孔。静置5min10min，将加样后的平皿轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内，置于37℃温箱，在24h、48h观察并记录结果。6.3.3.2抗体检测
中央孔加人标准IBD琼扩阳性抗原，第1孔、第4孔分别加人标准IBDV阳性血清和标准IBDV阴性血清，其他孔分别加人待检样品；或第1孔加入标准IBD阳性血清，其他孔分别加入倍比稀释的待检3
GB/T19167—2020
血清，20uL/孔。静置5min～10min将加样后的平Ⅲ轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内，置于37℃温箱，在24h、48h观察并记录结果。6.4试验成立条件
24h，标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间形成清晰沉淀线，标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阴性抗原孔之间未形成清晰沉淀线。6.5
结果判定
6.5.1病原检测
24h或48h，待检样品孔与标准IBDV阳性血清孔之间出现沉淀线，且与标准IBD琼扩阳性抗原沉淀线末端相吻合时，待检样品判为阳性；标准IBD琼扩阴性抗原孔和待检样品孔与标准IBDV阳性血清孔之间无沉淀线出现时，待检样品判为阴性（参见图B.1）。6.5.2抗体检测
待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间出现沉淀线，且与标准IBDV阳性血清沉淀线末端相吻合时，待检血清判为阳性：待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间无沉淀线出现时，待检血清判为阴性（参见图B.2)。
标准IBD琼扩阳性抗原孔与待检血清之间形成清晰沉淀线的血清最高稀释倍数，即判为待检血清琼扩效价。
7反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）7.1器材
PCR扩增仪
台式低温高速离心机。
7.1.3电泳仪和水平电泳槽。
凝胶成像仪（或紫外透射仪）。7.1.4
微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL等不同规格）。去核酸酶水处理的离心管与吸头。7.1.6
PCR扩增管。
7.2试剂
RT-PCR试剂
2X一步法RT-PCR缓冲液。
TaqDNA聚合酶-反转录酶-RNA酶抑制剂混合物。灭菌去离子水。
7.2.1.4引物
7.2.1.4.1上游引物+290:5-AGATTCTGCAGCCACGGTCTCT-3。2下游引物-861:5-TTGATGACTTGAGGTTGATTTT-3。7.2.1.4.2
7.2.2电泳试剂
7.2.2.1电泳缓冲液：50×TAE贮存液（配方见A.5），临用时加蒸馏水配成1XTAE缓冲液（配方见A.6）。4
琼脂糖：低熔点琼脂糖、
7.2.2.3电泳加样缓冲液：配方见A.77.2.3DNAMarker（标准分子量）分子大小范围100bp~2.000bp。
7.3样品准备
GB/T19167—2020
7.3.1本方法适用所有的IBD病原样品种类，包括法氏囊组织、鸡胚接种物、细胞培养物等7.3.2阳性对照：已知病毒材料，如IBDV感染的鸡胚或细胞。7.3.3阴性对照：IBDV阴性的鸡胚或细胞7.4试验程序
7.4.1核酸提取
7.4.1.1异硫氰酸胍法抽提核酸
见附录。
7.4.1.2核酸提取等效方法
可采用等效病毒RNA提取试剂或试剂盒进行核酸提取7.4.2核酸扩增
7.4.2.1引物：将引物（+290/-861)稀释到工作浓度10pmol/μL。7.4.2.2PCR反应混合液配制：每个PCR管中依次加入4.5μLddHzO、12.5aL2X一步法RT-PCR缓冲液、各1μL上下游引物（+290/—861）、1μLTaqDNA聚合酶-反转录酶-RNA酶抑制剂混合物。7.4.2.3RT-PCR扩增：其中2个PCR管中分别加人5uL阳性对照RNA提取物和5uL阴性对照RNA提取物：在其他PCR管中分别加入5μL待检样品RNA模板。盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增：50℃30min；94℃预变性2min；然后进行35个循环：95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸45s；最后72℃延伸5min；4℃保存备用。7.4.3电泳
7.4.3.11.0%琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中。加热融化后加1uL核酸染料（如Gelred），混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拨出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
7.4.3.2加样：取6μL8uLPCR扩增产物和2μL加样缓冲液混匀后加人一个加样孔。每次电泳同时设标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照。7.4.3.3电泳：电压80V~100V或电流40mA~50mA，电泳30min~40min。最后由凝胶成像系统观察并拍照记录。
7.5试验成立条件
电泳结束后，取出凝胶置凝胶成像仪（或紫外透射仪）上观察。阳性对照电泳结果应出现594bp扩增条带，同时阴性对照无扩增条带。5
GB/T19167—2020
结果判定
符合7.5的条件.被检样品扩增产物电泳出现594bp目标条带，符合阳性序列的特征，判为IBDV核酸阳性（参见附录D)；被检样品无扩增条带，判为IBDV核酸阴性。8实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timeRT-PCR）8.1器材
荧光定量PCR扩增仪。
台式低温高速离心机。
微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL等不同规格）。8.1.3
离心管与吸头。
8.1.5PCR扩增管（0.2mL)。
RT-PCR试剂
荧光定量RT-PCR试剂盒。
灭菌去离子水。
引物和探针。
8.2.1.3.1
IBDVP5F:5'-GAGCCTTCTGATGCCAACAAC-3'8.2.1.3.2
IBDVP5R：5-CAAATTGTAGGTCGAGGTCTCTGA-3。IBDVprobe:FAM-CGGCGTCCATTCCGGACGAC-BHQ18.2.1.3.3
样品准备
见7.3。
核酸提取
见7.4.1。
5核酸检测
将引物（IBDVP5F/IBDVP5R）和探针（IBDVprobe）稀释到工作浓度10pmol/μL。8.5.1
8.5.2按照荧光定量RT-PCR试剂盒说明书配置反应体系，每个PCR管中加人各1μL上下游引物、0.5μL探针。
8.5.3在其中一个PCR管中加入5μLIBDVRNA，设为阳性对照；在另一个PCR管中加人5μL超纯水，作为阴性空白对照；在其他PCR管中分别加入5μL待检样品RNA模板。8.5.4实时荧光RT-PCR反应程序为：50℃反转录10min；95℃预变性5min；然后进行40个循环：95℃105、60℃30s（检测荧光信号）。6试验成立条件
阳性对照品扩增曲线有明显对数增长期，且Ct值≤32；同时阴性对照品扩增曲线无对数增长期（参见附录E。
8.7结果判定
8.7.1试验成立，样品Ct值≤35，且出现标准的S形扩增曲线，判为阳性。8.7.2样品无Ct值或Ct值>38，且无标准扩增曲线，判为阴性。GB/T19167—2020
8.7.3样品359.1器材
倒置生物显微镜
冰箱（2℃～8℃、—20℃、-70℃不同温度）。9.1.2
9.1.3CO2恒温培养箱。
9.1.44℃离心机。
9.1.5微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL等不同规格）。9.1.61mL注射器。
25cm细胞培养瓶。
烧杯（100mL）。
水浴锅。
9.2试剂
9.2.10.01mol/LPBS(pH7.2),配方见A.1。9.2.2细胞培养液与细胞维持液，配方见A.4.2和A.4.3。0.25%胰酶，配方见A.4.4。
9.3试验细胞与动物
9.3.26日龄～8日龄SPF鸡胚。
9.3.3SPF鸡和IBD免疫鸡
试验程序
细胞培养分离病毒
制备CEF
参见附录F。
2接种病毒
待细胞长成单层后，先倒去细胞培养瓶（T25)中的营养液，加入1mL已经处理好的病料液，9.4.1.2.1
置37℃作用60min，中间每隔15min晃动一下细胞培养瓶，然后弃掉病料液，用维持液洗涤细胞面1次，再加5mL细胞维持液，37℃5%CO2培养箱培养。细胞对照瓶不接种样品，弃去营养液后加5mL细胞维持液
9.4.1.2.2观察和记录：每天观察有无CPE，CPE特征是细胞缩小，变圆，折光性增强。9.4.1.2.3
3盲传：如果接种6d后仍未见CPE，弃去培养液，将培养物反复冻融，收集细胞和病毒的冻融7
GB/T19167—2020
液，按9.4.1.2.1所述方法再接种生长48h的单层细胞进行盲传，即1mL第1代细胞/病毒液加4ml细胞维持液，37℃培养。如此盲传3代。9.4.2鸡胚分离病毒
9.4.2.1接种病毒
9.4.2.1.1将样品经绒毛尿囊膜接种于5枚9日龄～11日龄的SPF鸡胚。具体操作如下：分别在鸡胚无血管处和气室顶端打一小孔，用吸球在气室顶端孔处抽吸以制造人工气室，然后用注射器于鸡胚无血管处接毒，0.2mL/枚，之后将所打孔用蜡封闭，继续孵化9.4.2.1.2每日照胚，接种48h内死亡的鸡胚弃去不用。收集接种48h后死亡鸡胚，检查鸡胚病变血清I型IBDV的初次分离物就可引起部分鸡胚死亡。病变表现为萎缩、皮下水肿、充血，皮下或颅内出血，肝脏肿大、不均匀地充血、呈致斑驳病变。晚死的鸡胚肝肿大、变绿、有坏死灶；脾肿大，肾水肿、充血，呈斑纹状。血清II型IBDV不能引起感染鸡胚的皮下水肿和出血，但表现胚体小，呈灰黄色9.4.3鸡接种试验
取3周龄～6周龄的SPF鸡5只，每只滴眼0.05mL样品。接种后72h～96h将鸡处死，检查法氏囊、肾脏和胸肌有无病变。
病毒鉴定
对出现CPE的细胞培养液、出现病变的鸡胚和病死鸡，选用第7章或第8章进行核酸鉴定，也可选用第6章进行病原鉴定。
结果判定
9.6.1细胞盲传3代未见细胞病变或鸡胚传代未见病变，且经第6章、第7章或第8章中规定的任一方法检测阴性者，判定病毒分离阴性。9.6.2对出现CPE的细胞培养液或出现病变的鸡胚，经第6章、第7章或第8章中规定的任一方法检测阳性者，判为病毒分离阳性。综合判断
10.1符合第4章的流行病学特点、临床症状和剖检变化的病鸡，初步判断为IBD疑似病鸡10.2IBD疑似病鸡按照第6章、第7章、第8章或第9章中规定的任一方法，检测为病原学阳性的，判断为IBD确诊病鸡。
10.3不符合第4章的流行病学特点、临诊症状和剖检变化的鸡，临床无明显特异症状的动物（结合疫苗免疫状况）但是按照第6章、第7章、第8章或第9章中规定的任一方法，检测为病原学阳性的，判断为IBDV感染鸡。
A.10.01mol/LPBS(pH7.2)
氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI）
附录A
（规范性附录）
溶液配制（试剂要求分析纯）
磷酸氢二钠（NazHPO,·12H,O）磷酸二氢钾（KH,PO4）
去离子水
调节pH
加去离子水至
121℃高压灭菌30min，置于4℃冰箱备用。20.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）A.2
氯化钾（KCI）
磷酸氢二钠（Na2HPO,：12H,O)
磷酸二氢钾（KH,PO）
去离子水
调节pH
加去离子水至
121℃高压灭菌30min，置于4℃冰箱备用2.9g
1000mL
1000mL
PBSTL含0.05%（体积分数）吐温-20的0.01mol/LPBSpH7.2～7.4]A.3
0.01mol/LPBS
吐温-20
细胞培养液与细胞维持液
Eagle's-MEM
1000mL
GB/T19167—2020
Eagles-MEM营养液：Eagle's-MEM营养剂95g.加超纯水1000mL。溶解后过滤除菌，4℃保存备用。
细胞营养液
Eagle's-MEM营养液
特牛血清
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