GB/T 18936-2020.Diagnostic techniques for highly pathogenic avian influenza.
1范围
GB/T 18936规定了高致病性禽流感临床诊断,样品采集、保存与运输,病毒分离与鉴定,血凝和血凝抑制试验，禽流感病毒RT-PCR试验和禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验的技术要求。
GB/T 18936适用于高致病性禽流感的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
NY/T 765高致病性禽流感 样品采集 、保存及运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
高致病性禽流感 highly pathogenic avian influenza; HPAI
由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。
3.2
血凝 hemagglutinin;HA
流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白,具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性。
3.3
血凝抑制 hemagglutinin inhibition;HI
抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上,干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合,抑制了流感病毒HA凝集红细胞的能力。
3.4
反转录聚合酶链式反应 reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR
一种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术。先用RNA反转录为eDNA,然后以eDNA为模板进行PCR扩增的过程。

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18936—2020
代替GB/T18936—2003
高致病性禽流感诊断技术
Diagnostic techniques for highly pathogenic avian influenza2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
GB/T18936—2020
规范性引用文件
术语和定义
临床诊断
样品采集、保存与运输
病毒分离与鉴定
血凝和血凝抑制试验
禽流感病毒RT-PCR试验
禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验10综合判定：
附录A（规范性附录）试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制附录B（资料性附录）
附录C（资料性附录）
高致病性禽流感病毒IVPI测定试验血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法附录D（资料性附录）
禽流感病毒RT-PCR试验用引物
附录E（资料性附录）RT-PCR反应液配制附录F（资料性附录）
实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方10
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T18936—2020
本标准代替GB/T18936—2003《高致病性禽流感诊断技术》，与GB/T18936—2003相比，主要技术变化如下：
—增加了禽流感病毒RT-PCR试验（见第8章）；增加了禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验（见第9章）；删除了琼脂凝胶免疫扩散（AGID)试验（见2003年版的第4章）；删除了间接酶联免疫吸附试验（ELISA)（见2003年版的第5章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中华人民共和国北京海关、中国动物卫生与流行病学中心。
本标准主要起草人：王秀荣、田国彬、刘环、邓国华、蒋文明、施建忠、曾显营、李雁冰、谷强、孙晓东、陈化兰。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18936—2003。
1范围
高致病性禽流感诊断技术
GB/T18936-—2020
本标准规定了高致病性禽流感临床诊断，样品采集、保存与运输，病毒分离与鉴定，血凝和血凝抑制试验，禽流感病毒RT-PCR试验和禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验的技术要求。本标准适用于高致病性禽流感的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T765高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
高致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenzaHPAI由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。3.2
血凝hemagglutinin;HA
流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白，具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性。3.3
血凝抑制hemagglutinininhibition；HI抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上，干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合，抑制了流感病毒HA凝集红细胞的能力3.4
反转录聚合酶链式反应
reversetranscription-polymerasechainreaction;RT-PCR种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术。先用RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增的过程。3.5
实时荧光RT-PCR
real-timeRT-PCR
利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法。3.6
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。GB/T18936—2020
4临床诊断
易感动物
鸡、火鸡、鸭、鹅、鹑、雉鸡、鹧鸪、驼鸟、孔雀等多种离类易感，多种野鸟也感染发病、4.2临床症状
精神沉郁，嗜睡，头翅下垂，呆立；食欲不振；呼吸困难，有呼吸道症状4.2.2
鸡冠发、发紫：眼结膜发红：排黄、白、绿色稀便，并有未完全消化的饲料：脚鳞或有出血。4.2.3产蛋下降，软壳蛋、畸形蛋增多；有歪脖子等神经症状。鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状；有时可见角膜发红、充血、有分泌物，甚至失明。4.2.4
4.3剖检变化
4.3.1气管弥漫性充血、出血，有少量黏液；肺部有炎性症状。4.3.2腹腔有浑浊的炎性分泌物；肠道可见卡他性炎症；输卵管内有浑浊的炎性分泌物，卵泡充血、出血、萎缩、破裂，有的可见“卵黄性腹膜炎”：胰腺边缘有出血、坏死4.3.3心冠及腹部脂肪出血；腺胃乳头可见出血；盲肠扁桃体肿大出血；直肠黏膜及泄殖腔出血。4.4结果判定
出现4.2、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床疑似病例，需要进一步开展实验室诊断。5样品采集、保存与运输
5.1总则
样品采集、保存及运输应按照NY/T765进行。，样品采集宜在发病初期选择具有典型临床症状的禽进行，采样过程中应避免交叉污染。死禽或其他动物采集气管、肺和脑等组织样品，进行分别处理；活禽样品应包括咽喉和/或泄殖腔拭子；小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便5.2拭子样品
5.2.1采集咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液。5.2.2采集泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔至少旋转3圈并沾取少量粪便。5.2.3将采样后的拭子分别放人盛有1.2mL样品稀释液（配制方法见附录A中的A.1)的2mL采样管中，编号并填写相应采样单。5.3
组织样品
发病禽鸟可无菌采集气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器，装人15mL或50mL带螺口的有机材料保存管中，编号并填写相应采样单。5.4血清样品采集
无菌采集禽类的血液，每只约2mL，编号并填写相应采样单。待血液凝固，血清析出后，收集血清用于 HI 检测。
5.5样品保存和运输
GB/T18936-—2020
样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，宜24h内送实验室。样品应尽快处理，没有条件的可在4℃存放不超过4d，也可在低温条件下保存（一70℃贮存为宜）。6病毒分离与鉴定
6.1适用范围
病毒分离与鉴定方法适用于对HPAI的病原学诊断，应在有资质的高等级生物安全实验室操作，按照GB19489的规定执行。
6.2样品处理
将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子；粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨，按照1g组织加10mLPBS的比例配成悬液。样品液经3000r/min离心10min，取上清作为接种或者核酸检测材料6.3样品接种及收获
取处理好的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9d～11d无特定病原体鸡胚，每个样品接种3～5枚鸡胚，在37℃孵化箱内孵育，每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况。无菌收取死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测HA活性。6.4病毒鉴定
若无HA活性，则收取尿囊液进行盲传，至少盲传1代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性；若有HA活性说明可能有正黏病毒科的流感病毒，可进一步采用血凝和血凝抑制试验（见第7章）、高致病性离流感病毒IVPI(静脉内接种致病指数）测定试验（参见附录B)、禽流感病毒RT-PCR试验（见第8章）、禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验（见第9章）等方法进行验证。7血凝和血凝抑制试验
7.1适用范围
血凝和血凝抑制试验适用于血凝素亚型的诊断和抗体效价测定7.2试剂
7.2.1阿氏（Alsevers）液，配方参见A.2。7.2.21%鸡红细胞悬液，配方参见A.3。7.2.3pH7.2、0.0lmol/LPBS.配方参见A.4。7.2.4禽流感病毒血凝素分型标准抗原、标准阳性血清、阴性血清。7.3HA试验（微量法）试验步骤
7.3.1在96孔V型微量反应板中，每孔加0.025mLPBS7.3.2第1孔加0.025mL抗原或病毒液，反复吹吸3次～5次混匀。7.3.3从第1孔吸取0.025mL抗原或病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加人第3孔，进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。第12孔为PBS对照孔。GB/T18936—2020
7.3.4每孔加0.025mLPBS。
7.3.5每孔加入0.025mL1%（体积分数）鸡红细胞悬液。7.3.6结果判定。轻扣反应板混合反应物，室温（约20℃）静置40min，环境温度过高时可在4℃条件下静置60min，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。判定时，将反应板倾斜60℃，观察红细胞有无泪珠状流消，完全无泪珠样流尚（100%凝集）的最高稀释倍数判为血凝效价。7.4HI试验（微量法）试验步骤
7.4.1根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位（即4HAU)的病毒抗原。4HAU抗原应根据检验结果调整准确。
示例：如果血凝的终点滴度为1：256（2°或8log2），则4HAU=256/4=64（即1：64）；取PBS6.3mL，加抗原0.1mL，即通过1：64稀释获得4HAU。配制的4HAU抗原需检查血凝价是否准确，将配制的4HAU抗原进行系列稀释，使最终稀释度为1：2、1：3、1：4、1：5、1:6和1：7。从每一稀释度申取0.025mL，加人PBS0.025mL，再加入1%鸡红细胞悬液0.025mL.混勾。将血凝板在室温（约20.℃）条件下静置40min或4℃60min.如果配制的抗原液为4HAU.则1：4稀释度将出现凝集终点；如果高于4HAU.可能1：5或1：6为终点；如果低于4HAU,可能1：2或1：3为终点。
7.4.2第1孔～第11孔加人0.025mLPBS,第12孔加人0.05mLPBS作为空白对照。7.4.3第1孔加人0.025mL血清（鸭、鹅血清在检测时建议进行预处理.参见附录C)；第1孔血清与PBS充分混勾后吸取0.025mL于第2孔，依次2倍稀释至第10孔、从第10孔吸取0.025mL弃去。第11孔作为抗原对照。
7.4.4第1孔～第11孔均加入0.025mL4HAU抗原，在室温（约20℃）下静置30min或4℃60min。
7.4.5每孔加人0.025mL1%（体积分数）鸡红细胞悬液，震荡混勾，在室温（约20℃）下静置40min或4℃60min，空白对照孔（12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。7.4.6结果判定。当抗原对照孔（第11孔）完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于1：4（22或2log2)，阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。用于检测抗体，检测鸡血清时，HI抗体效价不高于1：8（23或3log2）判为阴性，不低于1：16（2或41og2）判为阳性。用于检测抗原，能够被某亚型禽流感标准血清抗体抑制，HI效价不低于1：16（2或4log2)时判定为该亚型阳性；HI抗体效价不高于1：8（23或31og2)判为阴性。对于疑似H5亚型等抗原性可能存在较大差别的病毒，应结合其他病毒检测方法进行鉴定。
8禽流感病毒RT-PCR试验
8.1适用范围
适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚培养物等物质中禽流感病毒核酸8.2仪器设备
PCR扩增仪及配套反应管。
8.2.2高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）。8.2.3IⅡ级生物安全柜，
微量移液器（5μL、10μL、100μL、1000uL)及配套吸头与1.5mL离心管。8.2.5电泳仪。
8.2.6电泳槽。
8.2.7紫外凝胶成像仪
8.3试剂
8.3.1推荐的禽流感病毒RT-PCR引物序列，参见附录D。8.3.2RT-PCR反应液，配方参见附录E的E.1。8.3.3无核酸酶水，配方参见E.28.3.4无水乙醇。
8.3.5阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。8.3.6
阳性对照为灭活的相应亚型禽流感病毒胚培养物。8.4RNA提取
可选市售商品化RNA提取试剂盒，按说明书进行。8.5RT-PCR操作
GB/T18936-—2020
取2.5μL(约250ng)提取的RNA加人RT-PCR反应液中，置于PCR仪中，循环参数为：45℃逆转录45min；94℃预变性2min；94℃30s.52℃45s.68℃45s，35个循环最后68℃延伸8min。8.6电泳
PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。8.7
结果判定
在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果。出现预期大小的扩增片段时，判定为核酸检测阳性，否则判定为阴性。9
禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验9.1
适用范围
实时荧光RT-PCR适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚尿囊液等物质中禽流感病毒核酸。9.21
仪器设备
9.2.1荧光PCR仪。
9.2.2其余器材同8.2.2~8.2.4。9.3试剂及引物探针序列
推荐的实时荧光RT-PCR引物探针序列参见附录F的F.1。9.4
样本核酸的提取
可选市售商品化RNA提取试剂盒，按说明书进行。9.5实时荧光RT-PCR操作
9.5.1实时荧光RT-PCR扩增试剂的准备与配制宜在专门的反应混合物配制区配制实时荧光RT-PCR扩增试剂。根据需要检测的样品数，按推荐GB/T18936—2020
的实时荧光RT-PCR反应液配方（参见F.2)配制反应液，充分混匀后分装，每个反应管15uL。转移反应管至样本制备区。
9.5.2加样
宜在专门的样本制备区进行。在9.5.1配好的反应管中分别加入9.4中制备的RNA溶液5μL（约500ng），使每管总体积达到20μL.记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后500r/min离心30s。9.5.3实时荧光RT-PCR反应设定
宜在专门的检测区进行实时荧光RT-PCR反应。将9.5.2中加样后的反应管放人实时荧光RTPCR检测仪内，编辑样品表后，选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的实时荧光RT-PCR反应参数设定参见F.3。9.6结果判定
9.6.1结果分析条件设定
综合分析仪器读取的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值（threshold）和基线（baseline），使仪器显示正确的结果。
9.6.2质控标准
9.6.2.1阴性对照检测通道读取数据无Ct值或Ct值>35并且无特征性扩增曲线。9.6.2.2阳性对照检测通道读取数据出现特征性扩增曲线，且Ct值应≤30。9.6.2.3
如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次试验视为无效9.6.3结果描述及判定
9.6.3.1若测定样品Ct值≤30.判为所用引物探针禽流感病毒特定型或亚型核酸阳性9.6.3.2若测定样品3035.判为阴性。综合判定
10.1疑似
出现4.2、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床疑似病例，若其H5或H7亚型的RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测阳性，可判为高致病性禽流感疑似病例10.2确诊
病毒分离物经HA和HI试验确定为流感病毒，且分离物的IVPI值大于1.2，判定为高致病性离流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亚型禽流感病毒，在HA裂解位点处具有与HPAI病毒相似的氨基酸序列,亦判定为高致病性禽流感病毒。分离到高致病性禽流感病毒的病例判定为高致病性禽流感确诊病例。
A.1样品稀释液
附录A
（规范性附录）
试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制样品稀释液的配制方法如下：
GB/T18936-—2020
a）A液：0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液。NaH,PO,·H,O27.6g，溶于蒸馏水中，最后定容至1000ml
B液：0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液。NazHPO4·7H.O53.6g.或NazHPO4·12H.O71.6gb)
或Na2HPO，·2H2O35.6g，加蒸馏水溶解，最后定容至1000mL。c)
0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）（含抗生素和稳定剂）的配制。取A液14mLB液36mL，加NaCl8.5g，用蒸馏水定容至1000mL。经121℃土2℃、15min高压灭菌，冷却后，无菌条件下分别加人青霉素2000U/mL、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）、霉菌抑制素（1000U/mL）和牛血清白蛋白（5mg/mL）。上述抗生素浓度宜用于组织和咽喉子，如果用作粪便和泄殖腔子的缓冲液，抗生素浓度可提高5倍。
A.2阿氏（Alsevers）液配制
称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.420g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1,69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。A.31%鸡红细胞悬液
采集至少三只SPF鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/LPBS洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%（体积分数红细胞悬液，4℃保存备用。
A.4pH7.2.0.01mol/LPBS的配制
pH7.2,0.01mol/LPBS的配制方法如下：a）
配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL。b)
配制1×PBS：量取40mL25×PB.加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2
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PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。GB/T18936—2020
B.1试验鸡
6周龄SPF鸡，10只。
B.2接种材料
附录B
（资料性附录）
高致病性禽流感病毒IVPI测定试验感染鸡胚的尿囊液，血凝价在1：16（2*或4log2）以上，未混有任何细菌、霉菌、支原体或其他病毒。
B.3接种方法
将感染鸡胚尿囊液用PBS1：10稀释，以0.1mL/羽的剂量翅静脉接种。每日观察每只鸡的发病及死亡情况，连续观察10d。
B.4记录方法
根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3。病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现，一般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉弊发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状。列举1个假设试验来说明IVPI的计算方法，参见表B.1和公式（B.1)。表B.1
假设高致病性禽流感病毒致病性试验记录结果临床症状
正常（a=0)
病鸡(b=1)
重病鸡（c=2）
死亡（d=3）
第1天第2天
第3天
第4天第5天第6天第7天
第8天第9天第10天
分类总计
注1：当IVPI值大于1.2时，判定分离株为高致病性禽流感病毒（HPAIV）。0
注2：本试验中IVPI=（0+0+20+198)/100=2.18>1.2.因此，本试验中的分离株为HPAIVB.5IVPI值计算
IVPI值计算参见公式（B.1)：
式中：
EaX0+.x1+,X2+ax3
a——10d累计正常鸡数；
-10d累计病鸡数；
-10 d累计重病鸡数；
10d累计死鸡数；
——10d累计记录10只鸡的总次数，即100。判定标准
GB/T18936—2020
...(B.1 )
当IVPI值大于1.2时，判定此分离株为高致病性禽流感（HPAI)病毒株。当IVPI值小于1.2时，H5和H7亚型的禽流感病毒应进行血凝素裂解位点的序列分析，如果氨基酸序列同其他高致病性流感病毒相似，被检测的分离物应被视为高致病性禽流感病毒。
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