中华人民共和国化工行业标准 HG/T4323—2012 循环冷却水中军团菌的检测与计数 Detection and enumeration of legionella in circulating cooling water 2012-11-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国工业和信息化部发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草，参考ISO11731:1998和ISO11731-2:2004编制，与其一致性为非等效。附录A和附录B为规范性附录。本标准由中国石油和化学工业联合会提出，并由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5）归口。起草单位包括石家庄开发区德赛化工有限公司、上海轻工业研究所有限公司、石家庄市疾病预防控制中心、中海油天津化工研究设计院及中国石油化工股份有限公司北京北化院燕山分院。主要起草人：李勇广、李静、李云、张全、和生、李丽婕、芦云红、郭玉梅、叶素妹。 1 范围 本标准规定了循环冷却水中军团菌的检测与计数方法。适用于循环冷却水、原水、生活用水及其他工业用水的军团菌检测，并可用于循环冷却水系统中沉积物和生物黏泥等样本的检测。 2 规范性引用文件 GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法（mod ISO 3696:1987） GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T27405 实验室质量控制规范食品微生物检测术语和定义 3 术语与定义 军团菌（Legionella）是一类革兰阴性杆菌，两端钝圆，有鞭毛，无芽孢和荚膜，大小约0.3～0.9μm×2～20μm，包括41个种属和61个血清型。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila, Lp）有15个血清型，是引起军团菌病的主要菌型。 4 安全 检测应符合GB/T27403的安全要求，并在BSL-2级生物实验室完成。检出军团菌的样品及培养基必须进行无害化处理。 5 方法提要 由于循环冷却水中军团菌数量通常低于直接涂布检测阈值，应通过膜过滤或离心浓缩水样。为减少杂菌抑制，对浓缩微生物可进行酸或热处理。随后将试样或滤膜转移到选择性GVPC培养基培养，生长的菌落为疑似军团菌。利用BCYE培养基和L-半胱氨酸缺失的BCYE-Cys培养基进行对比培养，可确认军团菌特性。附录A提供嗜肺军团菌鉴定方法，常规监测可不进行，但在疾病暴发或疑似病例时必须鉴定。 6 试剂和材料 6.1 所用试剂和水为分析纯试剂及GB/T6682三级水。 6.2 BCYE培养基：按附录B中B.1制备。 6.3 BCYE-Cys培养基：按附录B中B.2制备。 6.4 GVPC选择性培养基：按附录B中B.3制备。 6.5 酸缓冲液：按附录B中B.4制备。 6.6 Page'盐：按附录B中B.5制备。 6.7 氧化酶试剂：按附录B中B.6制备。 6.8 硝酸盐培养基：按附录B中B.7制备。 6.9 尿素琼脂：按附录B中B.8制备。 6.10 营养明胶：按附录B中B.9制备。 6.11 马尿酸水解试剂：按附录B中B.10制备。 6.12 军团菌胶乳凝集试剂盒。 7 仪器、设备 7.1 真空过滤系统。 7.2 微孔滤膜：直径47~50mm，孔径0.22~0.45μm。 7.3 黑色硝化纤维膜：直径47~50mm，孔径0.22~0.45μm。 7.4 接种环：直径3mm。 7.5 超声波振荡器。