HJ 775-2015.Water quality Ascarid ova determination Nature sedimentation method.
1适用范围
HJ 775规定了测定水中蛔虫卵的沉淀集卵法。
HJ 775适用于地表水和废水中蛔虫卵的测定。
当取样体积为10L时，本方法的检出限为5个/10L。
2规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
HJ/T 91地表水和污水监测技术规范
3方法原理
沉淀集卵法主要通过样品浓缩、杂质分离、镜检计数等环节对水中蛔虫卵进行测定。用60目筛网过滤去除样品中较大的杂质，利用蛔虫卵比重大于水和易于沉淀的特性过夜沉淀浓缩水样，用虹吸的方法弃去上清液，用表面活性剂吐温80作为残液及沉淀转移时的清洗剂，进一步离心浓缩转移的剩余物，收集到的浓缩物用乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，控制溶液pH值,获得最佳亲水-亲脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪类杂质，使蛔虫卵更易下沉。再次离心浓缩样品并弃去上部脂肪杂质层及缓冲液层，获得的含卵沉淀层用饱和硝酸钠溶液混匀,于计数框中静置漂浮后镜检，即可测得水样中蛔虫卵的数量。
5仪器和设备
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准A级玻璃量器。
5.1 显微镜:物镜4x、10x倍， 目镜10x倍。
5.2 冰箱: 0 °C~4 C。
5.3水平转子离心机:带50 ml螺口尖底离心管，离心力1000g以上。
5.4漩涡混匀器。
5.5 筛网: 60目，0250 um。
5.6不锈钢开口直壁容器: 10 L。
5.7开口直壁量筒: 1000 ml。
5.8虹吸管。
5.9洗瓶。
5.10螺口尖底离心管: 50 ml。
5.11 一次性巴氏滴管: 3ml、10 ml。
5.12微量移液器: 1000 μl。
5.13 定量计数框: 1 ml (网格)、5ml (S型)定量计数框。

中华人民共和国国家环境保护标准HJ775-2015
水质蛔虫卵的测定沉淀集卵法
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本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。2015-12-04发布
2016-01-01实施
适用范围
规范性引用文件
方法原理.
试剂和材料.
仪器和设备
分析步骤，
结果计算与表示
精密度
质量保证和质量控制
废物处理.
注意事项.
附录A
附录B
附录C
（资料性附录）硝酸钠水中溶解度、离心机离心力及转速计算公式（资料性附录）虫卵的鉴定
（资料性附录）虫卵配制样品的制备.4
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范水中虫卵的测定方法，制定本标准本标准规定了地表水和废水中蛔虫卵测定的沉淀集卵法。本标准为首次发布。
本标准的附录A～附录C为资料性附录。本标准由环境保护部科技标准司组织制订。本标准主要起草单位：常州市环境监测中心。本标准验证单位：上海市环境监测中心、江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、苏州市环境监测中心、徐州市环境监测中心站和泰州市环境监测中心站。本标准环境保护部2015年12月4日批准。本标准自2016年1月1日起实施
本标准由环境保护部解释。
1适用范围
水质蛔虫卵的测定沉淀集卵法
本标准规定了测定水中虫卵的沉淀集卵法本标准适用于地表水和废水中蛔虫卵的测定。当取样体积为10L时，本方法的检出限为5个/10L2规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
HJ/T91地表水和污水监测技术规范3方法原理
沉淀集卵法主要通过样品浓缩、杂质分离、镜检计数等环节对水中蛔虫卵进行测定。用60目筛网过滤去除样品中较大的杂质，利用蛔虫卵比重大于水和易于沉淀的特性过夜沉淀浓缩水样，用虹吸的方法弃去上清液，用表面活性剂吐温80作为残液及沉淀转移时的清洗剂，进一步离心浓缩转移的剩余物，收集到的浓缩物用乙酸一乙酸钠缓冲液混匀，控制溶液pH值获得最佳亲水-亲脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪类杂质，使虫卵更易下沉。再次离心浓缩样品并弃去上部脂肪杂质层及缓冲液层，获得的含卵沉淀层用饱和硝酸钠溶液混匀于计数框中静置漂浮后镜检，即可测得水样中虫卵的数量。4试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂，实验用水为新制备的蒸馏水或去离子水。
4.1乙酸乙酯（C4HgO2）。
4.2乙酸-乙酸钠缓冲液：pH=4.5。称取15.0g三水合乙酸钠（CHsCOONa?3H2O），溶于约800ml实验用水中，加入3.6ml乙酸（CHCOOH）调节pH值至4.5，用实验用水定容至1000ml。此溶液保质期为30d。4.3吐温80溶液：Φ（C24H44O6）=1%o移取1ml吐温80（Tween80），用实验用水稀释定容至1000ml，临用现配4.4饱和硝酸钠（NaNO）溶液。
称取略多于实验环境温度对应溶解度的硝酸钠（NaNO3），充分溶解于100g实验用水中，用滤纸滤去残渣，临用现配。硝酸钠在不同温度下的溶解度见附录A。5仪器和设备
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准A级玻璃量器。1
5.1显微镜：物镜4×、10×倍，目镜10×倍。5.2冰箱：0℃~4℃。
5.3水平转子离心机：带50ml螺口尖底离心管，离心力1000g以上。5.4漩涡混匀器。
5.5筛网：60目，250μm。
5.6不锈钢开口直壁容器：10L。5.7开口直壁量筒：1000ml。
5.8虹吸管。
5.9洗瓶。
5.10螺口尖底离心管：50ml。
5.11一次性巴氏滴管：3ml、10ml。5.12微量移液器：1000μl。
5.13定量计数框：1ml（网格）5ml（S型）定量计数框。6样品
按HJ/T91中对一般污染物采样的要求，用10L以上容积的塑料桶采样。采样前需用样品荡洗塑料桶，采集样品量应≥10L，常温下运回实验室，立即进行过滤（7.1）和沉淀（7.2）。7分析步骤
7.1过滤
充分摇匀样品，转入不锈钢开口直壁容器（5.6）至10L刻度。如样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，需将样品用筛网（5.5）过滤，并用吐温80溶液（4.3）清洗筛网（5.5）及杂质，洗液并入过滤后的10L样品中。
7.2沉淀
上述样品（7.1）在15℃～25℃室温下静置过夜沉淀12h～24h，用虹吸管（5.8）小心吸取并弃去上清液，避免扰动，保留1L含沉淀物的样品，转入1000ml开口直壁量筒（5.7），分别用50ml吐温80溶液（4.3）彻底清洗不锈钢开口直壁容器3次，洗液并入开口直壁量筒（5.7）。在15℃～25℃室温下再次静置过夜沉淀12h～24h，用虹吸管（5.8）吸取并弃去上清液，避免扰动，保留90ml～100ml含沉淀物的样品。注1：若样品中虫卵浓度在10倍检出限以上（>50个/10L），采样时，可只采总量不小于1L的样品取1L水样直接进行第二步的量简沉淀浓缩。当样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，同样应先将样品用筛网（5.5）过滤，并用吐温80溶液（4.3）清洗筛网及杂质，洗液并入1L样品中沉淀。7.3离心
沉淀浓缩后的样品（7.2）小心转移至3个螺口尖底离心管（5.10），分别用15ml吐温80溶液（4.3）彻底清洗开口直壁量筒3次，洗液均匀并入3个螺口尖底离心管。以1000g的离心力（离心机转速计算见附录A）离心15min，用巴氏滴管（5.11）小心吸取并弃去上清液，少量留之，避免带出沉淀。
用少量吐温80溶液（4.3）将3个离心管中的沉淀进行悬浮，将沉淀量少的2个离心管中的悬浮液并入沉淀量最多的一个离心管中；分别用3ml～5ml吐温80溶液彻底清洗被转移悬2
浮液的2个离心管，每支清洗3次，确保没有沉淀被丢弃，洗液并入沉淀量最多的离心管。以1000g的离心力离心15min，用巴氏滴管（5.11）小心吸取并弃去上清液，少量留之，避免带出沉淀。
7.4脂类杂质分离去除
用与离心后沉淀（7.3）等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液（4.2）对沉淀进行悬浮（即：离心后沉淀体积为2ml，加入2ml缓冲液）。如果离心后沉淀体积不足2ml，加入缓冲液至4ml。以确保用乙酸乙酯（4.1）浸提后，沉淀上方有足够体积的缓冲液，便于脂类杂质层完全倾出，且避免虫卵沉淀层的丢失。
加入2倍离心后沉淀（7.3）体积的乙酸乙酯（4.1），用涡旋混匀器（5.4）完全混合。以1000g的离心力离心15min，样品被分为清晰的三层。所有的非脂肪物质、重碎片，包括虫卵、幼虫和原生动物在底层：中间层是缓冲液层：脂肪和其他脂溶性物质在上方形成黑而厚的一层。
将上层和中间层液体平稳倾出弃去，记录底层沉淀体积。如有必要，可用细针在离心管壁四周对上层的脂肪层进行松动。7.5镜检
加入5倍底层沉淀（7.4）体积的饱和硝酸钠溶液（4.4），对分离去除脂类杂质后的含卵底层沉淀进行悬浮。该悬浮液可置于0℃～4℃冰箱（5.2）冷藏保存，备检，于1周内检测完毕，检测时需将其静置至室温。充分摇匀悬浮液，将其转入定量计数框（5.13），静置5min在显微镜下计数，直至全部悬浮液镜检完成。分别用1ml饱和硝酸钠溶液（4.4）充分洗涤镜检完的离心管3次，将洗液转入定量计数框（5.13），按以上步骤镜检。所有检测到的虫卵全部计数。
镜检时，需保持环境条件的稳定，无震动和风扰，缓移计数框，自上而下“U”型逐列计数。虫卵鉴定方法见附录B。
7.6空白对照试验
取10L同批次实验用水，按以上采样及分析步骤进行全程序空白样品的测定。结果计算与表示
8.1结果计算
统计全部计数的虫卵数，按公式（1）计算并报告10L水样中蛔虫卵数：CN
式中：
C水样中蛔虫卵浓度（个/10L）
N检测到的所有虫卵数（个）
Q—实际水样体积（10L）
8.2结果表示
水质中蛔虫卵的测定，实验最终结果取整表示，以“个/10L”为单位。3
精密度
6家实验室分别对实际样品和低浓度（20个/10L）、中浓度（40个/10L）、高浓度（80个/10L）自配样品的虫卵进行测定，实验室内相对标准偏差范围分别为：6.5%～18.9%，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%，8.9%~17.4%；实验室间相对标准偏差分别为5.8%、5.5%、4.9%、4.8%：重复性限（个/10L）为244、3、7、11；再现性限（个/10L）为260、3、7、11。10质量保证和质量控制
每批次样品至少做1个全程序空白试验，并取10%的样品进行平行样测定。全程序空白试验不得检出虫卵，平行样间的相对偏差不得超过30%。11废物处理
实验中虹吸液煮沸10min后可按普通废弃物处理，含乙酸乙酯的废弃液应集中保管，委托有资质的单位进行处理。
12注意事项
实验用过的器具均需进行高温灭活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。实验操作人员要注意自身防护，试验时要穿戴工作服、乳胶手套及口罩等，同时还要避免含虫卵的样品污染实验室环境。4
附录A
（资料性附录）
硝酸钠水中溶解度、离心机离心力及转速计算公式A.1硝酸钠在水中的溶解度
温度（℃）
A.2离心力计算公式
离心力按公式（A.1）进行计算。硝酸钠水中溶解度
溶解度（g）
RCF=r(rpm)2
式中：
相对离心力（g）
离心机半径（离心管中心至离心机轴的距离，cm）离心机转速（转/分）
-89456
A.3离心力转换为转速公式
离心机转速按公式（A.2）进行换算。rpm=
k·RCF
B.1蛔虫卵的形态特征
B.1.1受精蛔虫卵
附录B
（资料性附录）
蛔虫卵的鉴定
虫卵呈短椭圆形，大小为45um～75um×35um～50um。卵壳很厚，自外向内分为三层：受精膜、壳质层和武层，壳质层较厚，另两层极薄，在普通显微镜下难以分清。卵壳内有个大而圆未分裂的受精卵细胞，与卵壳间常见有新月形空隙。卵壳外有一层由虫体子宫分泌形成的蛋白质膜，其表面凹凸不平呈波浪状。随粪便排出的虫卵常被胆汁染成黄色或棕褐色。
B.1.2未受精蛔虫卵
虫卵呈长椭圆形或不规则形，大小为88um~94umx39um～44um，卵壳与蛋白质膜均较受精蛔虫卵薄，淡黄色，无试层，卵壳内含有许多大小不一的屈光颗粒。B.1.3感染期虫卵
卵内含有一条卷曲的幼虫。
B.1.4蛋白质膜脱落的虫卵
若蛔虫卵的蛋白质膜脱落，卵壳则呈无色透明，应注意与其他线虫卵的鉴别。B.2虫卵参考图片
B.2.1蛔虫卵模式图
屈光颗粒
卵细胞
蛋白质膜
受精烟虫卵
未受精虫卵
图B.1蛔虫卵模式图
B.2.2发育各阶段的虫卵
受精虫卵
未受精虫卵
脱去蛋白质膜的受精虫卵（左）感染期蛔虫卵
图B.2发育各阶段的蛔虫卵
附录 C
（资料性附录）
虫卵配制样品的制备
猪蛔虫（Ascarissuum）活成虫采集自屠宰场，用蒸馏水洗涤干净后，放置于含4%甲醛溶液内，0℃～4℃保存备用，可长期保存。制备虫卵备用液时，选取2～3条雌性蛔虫，用75%乙醇消毒过的解刀，划开虫体每条蛔虫一对子宫选取靠近阴门的一段(2mm～3mm)，解剖后，将含虫卵的内容物及组织碎片放入50ml离心管中，加入数颗直径1mm玻璃珠及10ml生理盐水，混匀后于涡旋混匀器振荡3min～5min，用260目网过筛，取40ml生理盐水分数次冲洗离心管和筛网，此时获得的滤液中蛔虫卵呈单个状态存在。滤液加入甲醛至终浓度为4%，0℃～4℃保存备用，可保存1个月。即制即用时可不添加甲醛。制备配制样品时，摇匀虫卵备用液，用1000ul微量移液器，立即吸取适量的蛔虫卵备用液于1ml定量计数框（网格）中，计数后用250μl微量移液器向计数框中添加或移出虫卵至所需数量。将计数框中所有的液体用吐温80溶液冲洗入配制样品中。再在显微镜下检测计数框，确保无虫卵残留。
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