HG 3616-1999.Bacillus thuringiensis technical.
1范圈
HG 3616规定了苏云金杆菌原粉的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。
HG 3616适用于防治鳞翅目害虫的苏云金杆菌原粉。
2引用标准
下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 1250-1989极限数值的表示方法和判定方法
GB/T 1600-1979(1989)农药水分测定方法
GB/T 1601-1993农药pH值的测定方法
GB/T 1604-1995 商品农药验收规则
GB/T 1605-1979(1989)商品农药采样方法
GB 3796-1983农药包装通则
GB/T 16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法
3要求
3.1 外观:灰白色至棕褐色粉末。
3.2 苏云金杆菌原粉应符合表1要求。
4.试验方法
除另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,所述溶液均为水溶液。
4.1 抽样
按照GB/T 1605-1979(1989)中“原粉采样”进行,用随机数表法确定抽样的包装件,最终抽样量应不少于100g。
4.2鉴别试验
当用生物测定法评价产品质量产生疑问时,可用以下方法进行鉴定。
用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000,同时测定其含量是否符合3.2指标的规定。
4.3 毒素蛋白含量测定方法
毒素蛋白含量可以用SDS- PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定,二者精密度、准确度接近,前者由于自动化程度更高,而定为仲裁法。

HG3616—1999
本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌原粉的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌生产提供了统一的技术依据。本标准的附录A是提示的附录，附录B是标准的附录。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标推主要起草单位：中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位：湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人：刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王绮文。1156
中华人民共和国化工行业标准
苏云金杆菌原粉
Bacillus thuringiensis technicalHG3616—1999
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）是目前应用最广泛的-种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000。范围
本标准规定了苏云金杆菌原粉的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于防治鳞翅目害虫的苏云金杆菌原粉。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1250—1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1600--1979（1989）农药水分测定方法GB/T1601—1993农药pH值的测定方法GB/T1604—1995商品农药验收规则GB/T1605--1979（1989）商品农药采样方法GB3796--1983农药包装通则
GB/T16150—1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3要求
3.1外观：灰白色至棕色粉末。
3.2苏云金杆菌原粉应符合表1要求。表1苏云金杆菌原粉控制项目指标项
毒素蛋白，%
毒力效价([Px IU /mgHa IU /mg])pH值
水分，%
细度，45 μm,%
一等品
合格品
注：Px 和 Ha 分别为小菜蛾(Plutella xylostella)和棉铃虫(Heliothis armigera)缩写。国家石油和化学工业局1999-06-16批准2000-06-01实施
4．试验方法
HG 3616--1999
除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样
按照GB/T1605--1979（1989)中“原粉采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于100g。
4.2鉴别试验
当用生物测定法评价产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，同时测定其含量是否符合3.2指标的规定。4.3毒素蛋白含量测定方法
毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1SDS-PAGE-扫描法（仲裁法）4.3.1.1方法提要
用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。
4.3.1.2仪器、设备
电泳仪。
夹芯式垂直电泳槽（1.5mm凹形带槽橡胶模框）、凝胶板面积145mm×100mm（1.5mm、12孔样品槽模具）。
高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机：10000r/min。
分析天平：精确至0.0001g。
4.3.1.3试剂和溶液
过硫酸铵（AP）。
二烷基硫酸钠（SDS)。
四甲基乙二胺(TEMED)。
氢氧化钠。
30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺30g，亚甲基双丙烯酰胺（原称：甲叉双丙烯酰胺）0.8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。1mol/I.、pH8.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷30.25g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至250mL。1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH6.8,用蒸馏水定容至100mL。电极缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用水溶解并定容至1 000 mL。
3×样品稀释液：1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl18.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL，巯基乙醇15mL，少许溴酚蓝，用蒸馏水定容至100mL。染色液：称取考马斯亮蓝（CBB)R-2501g，加入甲醇450mL，冰乙酸100mL，蒸馏水450mL，溶解过滤后使用。
脱色液：量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馏水定容至1000mL。1158
HG 3616- 1999
漂洗液：量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸馏水60mL，混合均勾后使用。毒素蛋白标样：毒素蛋白（相对分子质量为130000）含量为9.3%的原粉。4.3.1.4试样处理
称取标样、试样各20mg（准确至0.1mg），移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加人0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL（使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置约5min，再加人3×样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100℃沸水中煮6min，离心（2000r/min）10min后取上层清液，以备电泳上样。4.3.1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白
a）制备8%~10%骤丙烯酰胺凝胶
采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A（提示的附录）。b）上样
取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14μL（毒素蛋白含量约为3～7ug），作为标准曲线，再取定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为5ug）；加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c）电泳
电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1 cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%（体积百分数）乙酸中浸泡30min。d）染色
将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e）脱色
倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。
4.3.1.6测定
胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nm。
样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。mz×100
·式中：ml—从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量，μg，-2mL稀释液中样品的质量，mg；m2
V,--—样品最终定容体积，mL(3.75mL)；V
注入凝胶上样孔的样品体积，μL。4.3.1.7允许差
取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2SDS-PAGE-洗脱比色法
4.3.2.1方法提要
用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为原毒紊，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2仪器、设备
分光光度计。
其他同4.3.1.2。
4.3.2.3试剂和溶液
其他同4.3.1.3。
4.3.2.4试样处理
同4.3.1.4。
4.3.2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白
a）制备8%~～10%聚丙烯酰胺凝胶同4.3.1.5a)。
b）上样
HG 3616 - 1999
取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15、20、30、40、50μL（毒素蛋白含量约为7.5～25μg），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为15μg）,加人到上样孔中，注人电极缓冲液后,接通电源。c）电泳
同4.3.1.5c）。
d）染色
同4.3.1.5d)。
e）脱色
同4.3.1.5e)。
4.3.2.6测定
用手术刀刮下待测区带，放人玻璃试管中，再加25%吡啶（体积分数）3.0.mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝（CBB)R-250，平衡后用分光光度计，以25%吡啶为参比，于605nm下，测定浴液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。4.3.2.7允许差
取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.4毒力效价的测定
按附录B(标准的附录)进行。
4.5 pH值的测定
按GB/T1601測定。
4.6细度的测定
按GB/T16150—1995中2.2进行测定。4.7水分的测定
按GB/T1600-1979（1989)中“共沸蒸馏法”进行测定。5检验规则
应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6标志、标签、包装、贴运
6.1产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号。6.2原粉主要采用塑料袋包装，密封。6.3贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处。6.4运输时，注意轻放，防止损坏。6.5保证期：在正常贮运条件下，原粉质量保证期从生产日期算起为二年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含量不低于3.2指标，两年内产品力效价和毒案蛋白含量均不低于3.2指标的60%。1160
A1制板
HG3616--1999
附录A
（提示的附录）
电泳胶的制备
本实验选用板状电泳。具体操作根据实验室条件而定。基本操作大体上是根据电泳槽高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块一端带有2～3cm高的凹槽。两块玻璃板洗净干燥后，在无凹槽的玻璃板两边各放一条“间隙条”（塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要而定）。然后放上带凹槽的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块玻璃板之间就形成了定的间隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌人的胶液漏出。一般用胶纸条封闭，待灌入的胶凝固后，再撕去胶纸；或用1%～1.5%浓度的琼脂封闭，方法是：在琼脂中加人电极缓冲液或蒸馏水，在沸水浴中加热溶解，将带有间隙的玻璃板装置，垂直放在一个高3cm、宽3cm、比玻璃板宽而长的一个小槽内（商品电泳槽有配套装置），趁热将溶解的琼脂胶灌入小槽内，待冷却后取出玻璃板装置，下端即封严，可进行灌注聚丙烯酰胺胶液。A2制备分离胶
从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按表A1先配制分离胶。本试验中分离胶浓度为10%。将胶液配好、混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的蒸馏水，加蒸馏水时通常顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约20～30 min左右使之凝。此时，在凝胶和蒸馅水之间可以看到很清晰的一条界面。然后吸出胶面上的蒸馏水。
A3制备浓缩胶
其用量根据实际情况而定，制备方法按表A1。表 A1 SDS-PAGE凝胶的配方
贴备液
30%丙烯酰胺
1 mol/L、pH8.8三羟基甲基氮基甲烷-HCl1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl蒸馏水
10%十二烷基硫酸钠
10%过硫酸铵
四甲基乙二胺
分离胶
浓缩胶
20 μL
混合上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，而后倒出。然后把余下的胶液注人玻璃板间隙，使胶液面与玻璃板凹处平齐，而后插人“梳子”，在室温放置20～30min，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破。取出梳子后，在形成的胶孔中加人蒸馏水，冲洗未凝的丙烯酰胺等，倒出孔中蒸馏水，再加人电极缓冲液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。1161
B1毒力效价测定方法之一
B1.1试剂或材料
HG 3616—1999
附录B
（标准的附录）
毒力效价的测定
用小菜蛾（Plutellaxylostella）作试虫的测定方法（仲裁法）标准品：CS-95,Hsab，效价20 000IU/mg。小菜蛾幼虫：Plutella xylostella。食用菜籽油。
酵母粉：工业用。
维生素 C:医用，分析纯。
琼脂粉：凝胶强度大于300g/cm2。磷酸氢二钾：分析纯。
磷酸二氢钾：分析纯。
聚山梨酯-80:粘度3.5×10-45.5×10-m2/s。菜叶粉：甘蓝型油菜叶，80℃烘干，磨碎，过80目筛。蔗糖：分析纯。
纤维素粉 CF-11。
氢氧化钾：分析纯。
氯化钠：分析纯。
15%尼泊金：对羟基苯甲酸甲酯（化学纯)溶于95%乙醇。10%甲醛溶液：甲醛（分析纯）溶于蒸馏水。干酪素溶液：干酪素(BR生物试剂)2g加0.001mol/L氢氧化钾2mL,8mL蒸馏水，灭菌。磷酸缓冲液：氯化钠8.5g磷酸氢二钾6.0g，磷酸二氢钾3.0g;聚山梨酯-80溶液0.1mL；蒸馏水1000mL。
B1.2仪器、设备
磨口三角瓶：250mL。
分析天平：精确到0.1mg。
电动搅拌器：无级调速，1006000r/min。医用手术刀。
振荡器。
水浴锅。
养虫管：9cm×2.5cm。
烧杯：50mL。
试管:18 mmX180 mm。
玻璃珠：$5mm。
移液管：10 mL。
B1. 3 测定步骤
B1.3.1感染液的配制
a）标准品免费标准bzxz.net
用分析天平准确称取标准品100.0~150.0mg（精确到0.1mg），装人250mL装有10粒玻璃珠的1162
HG 3616--1999
磨口三角瓶中。加人100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在振荡器上振荡30min。得到浓度约为1mg/mL的标准品母液（该母液在4℃冰箱中可存放10天）。然后将标准品母液稀释成浓度为1.000.0.500、0.250、0.125、0.0625.0.0313mg/mL六个稀释感染液。b）可湿性粉剂样品
称取相当于标推品毒力效价的样品适量（精确到0.2mg），加100mL磷酸缓冲液，然后参照标准品的配制方法配制样品感染液。
c）悬浮剂样品
将样品振荡20min，充分摇匀。用移液管吸取样品10.00mL，加人装有90mL无菌蒸馏水的磨口三角瓶中，吸洗三次，充分摇勾得到含100μL/mL的母液。将母液稀释成含量分别为5.000、2.500、1.250、0.625、0.313和0.156μL/mL六个稀释液。对有些效价过高或过低的样品，在测定前需先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计LCs0值(半致死中浓度)的范围，据此设计稀释浓度。B1.3.2感染饲料的配制
饲料配方：维生素 C 0.5g、干酪素溶液 1. 0 mL、菜叶粉 3. 0g、酵母粉1.5g、维生素粉 1.0g、琼脂粉2.0g、蔗糖 6.0g、菜籽油0.2mL、10%甲醛溶液0.5mL、15%尼泊金1.0mL、蒸馏水100mL。将蔗糖、酵母粉、干酪紊溶液、琼脂粉加人90mL.的蒸馏水中调匀。搅拌煮沸，使琼脂完全熔化，加人尼泊金，搅勾。将其他成分用剩余的10mL蒸馏水调成糊状。当琼脂冷却至75℃左右时与之充分混合，搅勾，置55℃水浴锅中保温备用。取50mL烧杯7只，写好标签，置55℃水浴中预热；分别向每个烧杯中加人1mL对应浓度的感染液，缓冲液作空白对照。向每个烧杯中加人 9mL熔化的感染饲料；用电动搅拌器搅拌20s，使每个烧杯中的感染液与饲料充分混勾。：将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1 cm×1 cm的饲料块，每个浓度取 4个饲料块分别放人4支养虫管中，每管放人一块，写好标签。B1.3.3接虫感染
随机取已放置饲料的养虫管，每管投人10头小菜蛾三龄初幼虫，每浓度4管，塞上棉塞，写好标签，在相同饲养条件下饲养。
B1.4结果检查及计算
感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。
计算标准品和样品各浓度的供测昆虫死亡率，查Abbott表或用式(B1)计算校正死亡率(X,)。对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。X
式中：T—处理死亡率;
C——对照死亡率。
·(B1)
将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡机率值，用最小二乘法分别求出标准品LCso值和待测样品LCso值，然后按式(B2)计算待测样品的毒力效价(Xz)[PxIU/mg(μL)或Ha IU/mg(μL)]：
式中：S——标准品LCso值；
P——标准品效价，
Y——样品LCso值。
B1.5允许差
（B2）
HG3616—1999
毒力测定法允许相对偏差，但每个样品3次重复测定结果最大相对偏差不得超过20%。毒力测定制剂名浓度所引起的死亡率应在10%～90%之间，在50%死亡率上下至少要各有两个浓度。B2毒力效价测定方法之二-
B2.1试剂或材料
以棉铃虫（Heliothis armigera）作试虫的测定方法标准品：CS-95，Hab，效价20000IU/mg。棉铃虫幼虫;Heliothis armigera。黄豆粉：黄豆炒熟后磨碎过60目筛。大麦粉：过60目筛。
酵母粉：工业用。
36%乙酸溶液：乙酸（化学纯），溶于蒸馏水。苯甲酸钠：分析纯。
甲醛：分析纯。
维生素 C,医用，分析纯。
琼脂粉：凝胶强度大于300g/cm2。磷酸缓冲液:同B1.1。
B2.2仪器、设备
分析天平：精确到0.1mg。
电动搅拌器：无级调速，100～6000r/min。微波炉或电炉。
振荡器。
水浴锅。
组织培养盘：24孔。
糖瓷盘：30cm×20cm。
磨口三角瓶：250mL，具塞。
大烧杯：1000mL。
小烧杯50mL。
试管:18 mmX180 mm。
玻璃珠：5 mm。
注射器：50mL。
标本缸。
恒温培养箱。
B2.3测定步骤
B2.3.1饲料准备
饲料配方：酵母粉12g、黄豆粉24g、维生素C1.5g、苯甲酸钠0.42g、36%乙酸3.9mL、蒸馏水300 ml
将黄豆粉、酵母粉、维生素C、苯甲酸钠和36%乙酸放人大烧杯内，加100mL蒸馏水湿润，另将余下200mL蒸馏水加入琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全熔化，取出冷却至70℃，即与其他成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1min，迅速移至60℃水浴锅中加盖保温。B2.3.2感染液的配制
称100,0～150.0mg可湿性粉剂样品，至盛有玻璃珠的磨.口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液100mL，浸泡10min，在振荡器上振荡1min即成母液。或将悬浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00mL，至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液99mL，漫泡10min，在振荡器上麓荡1min即成母液，于分1164
HG3616—1999
析天平上称取150.0～300.0mg标准品（精确到0.1mg），如上法制成母液。将样品和标准品母液用磷酸缓冲液以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设一缓冲溶液作对照，每一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯内待用，对照吸取3mL磷酸缓冲液。B2.3.3饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器高速搅拌0.5min，迅速倒人组织培养盘上各小孔中（倒入量不要求一致，以铺满孔底为准），凝固待用。B2.3.4接虫感染
于26.～30℃室温下，将未经取食的初孵幼虫（孵化后12h内）抖入直径20cm的标本缸中，静待数分钟选取肥上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫。每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立放于30℃恒温培养箱内培养72h。B2.4结果检查和统计分析
用肉眼或放大镜检查死、活虫数。以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式(B1)计算校正死亡率。对照死亡率在 6%以下不用校正,6%～15%之间需校正，大于15%则测定无效。将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成机率值，用最小二乘法分别求出标准品和样品的LCso，按式(B2)计算毒力效价。B2.5允许差
毒力测定方法的允许相对偏差要求与B1,5相同。1165
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