DB32/T5099—2025
甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程
Technical code of practice for molecular detection of Alternaria brassicicola on cole vegetables
发布日期：2025-03-25
实施日期：2025-04-25
江苏省市场监督管理局
中国标准出版社

前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意，本文件的某些内容可能涉及专利，本文件发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由江苏省园艺标准化技术委员会提出、归口并组织实施。
本文件起草单位：江苏省农业科学院、江苏省农业技术推广总站、江苏益禾农业科技有限公司。
本文件主要起草人：余方伟、曾晓萍、李建斌、夏冬健、王神云、张伟、杨伟国、周哈昕、黄鹏、王桂楼

目录
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 缩略语
5 原理
6 试剂和材料
7 仪器设备
8 试验步骤
9 结果判定
附录A（资料性）甘蓝类蔬菜黑斑病
附录B（规范性）RPA产物电泳图

1 范围
本文件规定了甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测的原理、试剂和材料、仪器设备、试验步骤和结果判定。
本文件适用于甘蓝类蔬菜叶片、花茎、角果等部位黑斑病菌的分子检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2965 植物病原真菌分子生物学检测规范

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 Alternaria brassicicola 芸莹生链格孢
引起甘蓝类蔬菜黑斑病的主要病原，属半知菌亚门，丝孢目，暗色菌科，链格孢属。注：甘蓝类蔬菜黑斑病症状及病原菌形态特征见附录A。

4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）
RPA：重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification）
Tris：三羟甲基氨基甲烷 [Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
TAE：三羟甲基氨基甲烷/乙酸/乙二胺四乙酸（Tris/acetic acid/ethylenediamine tetraacetic acid）

5 原理
重组酶聚合酶扩增是一种快速分子检测技术，主要依靠重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶，在特定恒温条件下实现对甘蓝类蔬菜黑斑病菌靶标序列的高效扩增。
RPA反应开始时，重组酶在三磷酸腺苷的参与下结合引物，形成重组酶引物复合体。这些复合体能够扫描与引物序列互补的靶标双链DNA，然后侵入5'端位点，随后单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。最后链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸。以上步骤循环进行，实现甘蓝类蔬菜黑斑病菌靶标序列的指数式扩增。

6 试剂和材料
6.1 水：实验室用水符合 GB/T 6682 的规定。
6.2 RPA所用的引物序列见表1。
表1 引物序列
正向引物序列 (5'-3')：CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACCGTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC
6.3 液氮
6.4 基因组DNA提取试剂盒
6.5 RPA试剂盒：包含A缓冲液、B缓冲液和含有冻干粉剂的反应管
6.6 DNA抽提液：Tris、饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比 25:24:1 混合
6.7 50×TAE缓冲液（pH 8.5)
6.8 琼脂糖
6.9 核酸染料
6.10 DL2000 DNA marker
6.11 微量移液器配套的带滤芯吸头
6.12 离心管：1.5 mL

7 仪器设备
7.1 电子天平：分度值为 0.001g
7.2 台式低温高速离心机：转速 13000r/min，温度 4℃可控
7.3 微量移液器：量程分别为 2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL 和 1000 μL
7.4 PCR仪或恒温水浴锅
7.5 4℃冰箱和-20℃冰箱
7.6 水平电泳仪
7.7 凝胶成像仪

8 试验步骤
8.1 样品采集
样品保存于 4℃ 冰箱，保存期不超过 48h。
8.2 样品处理
按照 SN/T 2965 的规定处理样品，处理后的样品置于液氮中充分研磨，称取约 100mg 于 1.5mL 离心管中，使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，保存于-20℃ 冰箱备用。