本文件描述了饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和动物源性饲料原料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定。 本文件液相色谱-串联质谱法的检出限为2.5 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg；高效液相色谱法的检出限为0.25 mg/kg，定量限为0.50 mg/kg。

ICS65.120
CCSB46
中华人民共和国国家标准
GB/T21037—2024
代替GB/T21037—2007
饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基芒氨嘧啶的测定
Determination of diaveridine, trimethoprim and ormetoprim in feeds2024-03-15发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-10-01实施
GB/T21037—2024
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本文件代替GB/T21037一2007《饲料中三甲氧芊胺嘧啶的测定GB/T21037一2007相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)
高效液相色谱法》，与
增加了二甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定方法(见第1章)；适用范围中增加了精料补充料和动物源性饲料原料（见第1章）；更改了检出限和定量限（见第1章，2007年版的第1章）；增加了液相色谱-串联质谱法（见第4章）；更改了原理（见5.1，2007年版的第3章）；更改了试验步骤（见5.5，2007年版的第7章）；更改了精密度（见5.7，2007年版的第9章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。本文件起草单位：四川威尔检测技术股份有限公司、山东省畜产品质量安全中心、通威农业发展有限公司。
本文件主要起草人：张凤秤、王鑫、李俊玲、唐华英、孙延军、杜雪莉、杨发树、张璐。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：-2007年首次发布为GB/T21037—2007；本次为第一次修订。
1范围
GB/T21037—2024
饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧芒氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定
本文件描述了饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基芙氨嘧啶的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和动物源性饲料原料中二甲氧氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定。本文件液相色谱-串联质谱法的检出限为2.5ug/kg，定量限为5.0ug/kg；高效液相色谱法的检出限为0.25mg/kg，定量限为0.50mg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682
GB/T20195
术语和定义
分析实验室用水规格和试验方法动物饲料试样的制备
本文件没有需要界定的术语和定义。液相色谱-串联质谱法（仲裁法）4
4.1原理
试样中的待测物在弱碱性条件下用乙酸乙酯提取、正已烷脱脂，混合型强阳离子交换小柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4.2
试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T6682，一级。
甲醇：色谱纯。
乙腈：色谱纯。
甲酸：色谱纯。
乙酸铵：色谱纯。
氨水。
GB/T21037—2024
4.2.7乙酸乙酯。
4.2.8乙酸钠溶液（82g/L）：称取8.2g乙酸钠，用水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，混匀。4.2.95%乙酸溶液：移取5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。4.2.101%乙酸-乙腈溶液：移取1mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用乙腈（4.2.3）稀释、定容，混匀。4.2.11乙腈-5%乙酸溶液：移取10mL乙（4.2.3）于100mL容量瓶中，用5%乙酸溶液（4.2.9）稀释、定容，混匀。
4.2.12正已烷乙饱和溶液：量取80mL正已烷于100mL分液漏斗中，加入10mL乙腈（4.2.3）后，剧烈振摇5min，静置分层后，弃去乙腈层。4.2.138%氨水-甲醇溶液：量取50mL甲醇（4.2.2)于100mL容量瓶中，再加人8mL氨水（4.2.6），用甲醇稀释、定容，混匀。
4.2.140.2%甲酸溶液：量取500mL水于1000mL容量瓶中，加入2mL甲酸（4.2.4），用水稀释、定容，混匀。
4.2.15乙酸铵-0.2%甲酸溶液：称取0.154g乙酸铵（4.2.5），用0.2%甲酸溶液（4.2.14）溶解，转移至1000mL容量瓶，定容，混匀。
4.2.16复溶液：移取150mL乙腈（4.2.3）于1000mL容量瓶中，用乙酸铵-0.2%甲酸溶液（4.2.15）定容，混匀。
4.2.17标准储备溶液（1mg/mL）：称取二甲氧苄氨嘧啶（CAS：5355-16-8，纯度不低于98%）、三甲氧苄氨嘧啶（CAS：738-70-5，纯度不低于98%）和二甲氧甲基苄氨嘧啶（CAS：6981-18-6，纯度不低于98%）标准品各10mg（精确至0.01mg），分别置于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙睛溶液（4.2.10）溶解、定容，混匀。一18℃以下贮存，有效期6个月。4.2.18混合标准中间溶液I（10ug/mL)：分别准确移取二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基芋氨嘧啶标准储备溶液（4.2.17)各1mL于100mL容量瓶中，用1%乙酸-乙溶液（4.2.10）稀释、定容，混匀。一18℃以下贮存，有效期3个月。4.2.19混合标准中间溶液IⅡ（1μg/mL）：准确移取1mL混合标准中间溶液I（4.2.18）于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液（4.2.10）稀释、定容，混匀。临用现配。4.2.20内标标准储备溶液（1mg/mL）：称取dg-三甲氧苄氮嘧啶（CAS：1189460-62-5，纯度不低于98%）标准品10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液（4.2.10）溶解、定容，混匀。一18℃以下贮存，有效期6个月。SZC
4.2.21内标中间溶液（10μg/mL）：准确移取1mL内标标准储备溶液（4.2.20）于100mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液（4.2.10)稀释、定容，混匀。一18℃以下贮存，有效期3个月。4.2.22内标工作溶液（1μg/mL）：准确移取1mL内标中间溶液（4.2.21)于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液（4.2.10)稀释、定容，混匀。临用现配。4.2.23混合标准系列溶液：准确移取适量体积的混合标准中间溶液IⅡI（4.2.19）及100μL内标工作溶液（4.2.22)于10mL容量瓶中，用复溶液（4.2.16）稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL和内标质量浓度均为10ng/mL的混合标准系列溶液。临用现配。
4.2.24混合型强阳离子交换小柱：60mg/3mL，或性能相当者。4.2.25微孔滤膜：0.22um，有机系。4.3仪器设备
4.3.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI)。2
2分析天平：精度为0.1mg、0.01mg。4.3.2
：涡旋混合器。
4冷冻离心机：转速不低于10000r/min。4.3.4
超声波清洗器。
固相萃取装置。
氮吹仪。
GB/T21037—2024
按照GB/T20195规定制备试样，至少200g，粉碎使其全部过0.425mm试验筛，混合均匀，装入密闭容器中，备用。
试验步骤
4.5.1提取
平行做2份试验。称取试样约2g（精确至0.1mg），置于50mL离心管中，加入100μL内标工作溶液（4.2.22）、10mL乙酸钠溶液（4.2.8）和0.5mL氨水（4.2.6），涡旋混合2min，准确加人10mL乙酸乙酯（4.2.7），涡旋混合2min，超声提取10min（5min涡旋混合1次），于4℃下10000r/min离心5min，移取上层有机相至另一50mL离心管中。再准确加入10mL乙酸乙酯（4.2.7)重复提取1次，合并有机相，混匀。准确移取2mL有机相，50℃下氮气吹至近干，加人3mL乙睛-5%乙酸溶液（4.2.11）溶解残渣，涡旋混合30S，再加人3mL正已烷乙饱和溶液（4.2.12），涡旋混合30S，于4℃下10000r/min离心5min，弃去上层正已烷溶液，取全部下层溶液，备用。注：若提取液乳化严重，弃去上层正已烷溶液后，用3mL正已烷乙腈饱和溶液（4.2.12)重复脱脂。4.5.2净化
混合型强阳离子交换小柱依次用3mL甲醇（4.2.2）、3mL乙-5%乙酸溶液（4.2.11)活化，取备用液（4.5.1）全部过柱。分别用3mL乙-5%乙酸溶液（4.2.11）、3mL甲醇（4.2.2）淋洗，抽干后加入5mL8%氨水-甲醇溶液（4.2.13）洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹至近干，准确加人1mL复溶液（4.2.16），涡旋混合30S，过微孔滤膜（4.2.25），滤液待测。4.5.3测定
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：Cs柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.8μm，或性能相当者；b)
柱温：35℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：3L；
流动相：A相为乙腈（4.2.3)，B相为乙酸铵-0.2%甲酸溶液（4.2.15），梯度洗脱程序见表1。3
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时间/min
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
梯度洗脱程序
A相/%
电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）；检测方式：多反应监测（MRM)；毛细管电压：4.0kV；
离子源温度：350℃；
脱溶剂气温度：300℃；
脱溶剂气流速：7L/min。
多反应监测（MRM)定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2。表2
待测物名称
二甲氧苄氨嘧啶
三甲氧苄氨嘧啶
二甲氧甲基苄氨啶
d-三甲氧氨嘧啶
多反应监测(MRM)离子对、碰撞能量参考值定性离子对
261.2>245.0
261.2>123.3
291.3>230.2
291.3>261.0
275.4>259.3
275.4>123.3
300.2>234.0
混合标准系列溶液和试样溶液测定定量离子对
261.2>245.0
291.3>230.2
275.4>259.3
300.2>234.0
B相/%
碰撞能量
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（4.2.23）和试样溶液（4.5.2）上机测定。混合标准
溶液中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶和d。-三甲氧芋氨嘧啶的定量离子色谱图见附录A。
在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中待测物的保留4
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时间一致，其相对偏差在士2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
最大允许偏差
>20%50%
>10%~20%
以标准溶液中待测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中待测组分的质量浓度和内标质量浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测组分质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。4.6
试验数据处理
试样中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧芋氨嘧啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶含量以质量分数w计，数值以微克每千克（μg/kg)表示。多点校准按公式（1)计算；单点校准按公式（2)计算：w;=PXV×V.×1000
V×m×1000
式中：
式中：
由标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL）；净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；净化用试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g）)；
换算系数。
AXA.Xp.Xp;×VXV:X1000
AXA,×ps×V,XmX1000
试样溶液待测物色谱峰面积；
标准溶液内标物色谱峰面积；
标准溶液待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样溶液内标物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL）；一净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；标准溶液待测物色谱峰面积
试样溶液内标物的色谱峰面积；标准溶液内标物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；净化用试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g)；
换算系数
测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。.（1）
·（2）
GB/T21037—2024
4.7精密度
在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。5高效液相色谱法
5.1原理
试样中的待测物在弱碱性条件下用乙酸乙酯提取、正已烷脱脂，混合型强阳离子交换小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。5.2试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水：GB/T6682，一级。
甲醇：色谱纯。
5.2.3乙腈：色谱纯。
5.2.4氨水。
5.2.5乙酸乙酯。
乙酸钠溶液（82g/L）：称取8.2g乙酸钠，用水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，混匀。5.2.75%乙酸溶液：移取5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。5.2.81%乙酸溶液：移取10mL冰乙酸于1000mL容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。5.2.9乙-5%乙酸溶液：移取10mL乙腈（5.2.3）于100mL容量瓶中，用5%乙酸溶液（5.2.7)稀释、定容，混匀。
5.2.10正已烷乙腈饱和溶液：量取80mL正已烷于100mL分液漏斗中，加入10mL乙腈（5.2.3），剧烈振摇，静置分层后，弃去乙睛层。5.2.118%氨水甲醇溶液：量取50mL甲醇（5.2.2）于100mL容量瓶中，再加入8mL氨水（5.2.4），用甲醇稀释、定容，混匀。
5.2.12磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L)：准确称取6.80g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，用水溶解、定容，混匀。
5.2.13标准储备溶液（1mg/mL）：称取二甲氧芋氨嘧啶（CAS：5355-16-8，纯度不低于98%）、三甲氧苄氨嘧啶（CAS：738-70-5，纯度不低于98%）、二甲氧甲基苄氨嘧啶（CAS：6981-18-6，纯度不低于98%）标准品各10mg（精确至0.01mg），分别置于10mL容量瓶中，用1%乙酸溶液（5.2.8）溶解、定容，混匀。2℃～8℃贮存，有效期3个月。
5.2.14混合标准中间溶液（20μg/mL)：分别准确移取二甲氧氨嘧啶、三甲氧莘氨嘧啶、二甲氧甲基芊氨嘧啶标准储备溶液（5.2.13)各1mL于50mL容量瓶中，用1%乙酸溶液（5.2.8)稀释、定容，混匀。临用现配。
5.2.15混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.2.14）于10mL容量瓶中，用1%乙酸溶液（5.2.8)稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为0.1ug/mL、0.2ug/mL、1.0ug/mL、2.0ug/mL、5.0ug/mL和10.0μg/mL的混合标准系列溶液。临用现配。5.2.16混合型强阳离子交换小柱：60mg/3mL，或性能相当者。5.2.17微孔滤膜：0.45μm，水系。5.3仪器设备
5.3.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。6
5.3.2分析天平：精度为0.1mg和0.01mg。5.3.3涡旋混合器。
5.3.4冷冻离心机：转速不低于10000r/min。5.3.5
超声波清洗器。
固相萃取装置。
氮吹仪。
同4.4。
试验步骤
5.5.1提取
GB/T21037—2024
平行做2份试验。称取试样约2g（精确至0.1mg），置于50mL离心管中，加入10mL乙酸钠溶液（5.2.6）、0.5mL氨水（5.2.4），涡旋混合2min，准确加入10mL乙酸乙酯（5.2.5），涡旋混合2min，超声提取10min（5min涡旋混合1次），于4℃下10000r/min离心5min，上层有机相移至另一50mL离心管中，再准确加入10mL乙酸乙酯（5.2.5）重复提取1次，合并有机相，混匀。准确移取10mL有机相，50℃下氮气吹至近干，加入6mL乙-5%乙酸溶液（5.2.9），涡旋混合30s，再加人6mL正已烷乙饱和溶液（5.2.10），涡旋混合30s，于4℃下10000r/min离心5min，弃去上层正已烷溶液，取全部下层溶液，备用。
注：若提取液乳化严重，弃去上层正已烷溶液后，用6mL正已烷乙睛饱和溶液（5.2.10)重复脱脂5.5.2净化
混合型强阳离子交换小柱依次用3mL甲醇（5.2.2）、3mL乙睛-5%乙酸溶液（5.2.9）活化，准确加入3mL备用液（5.5.1）过柱。分别用3mL乙睛-5%乙酸溶液（5.2.9）、3mL甲醇（5.2.2）淋洗，抽干后加人5mL8%氨水甲醇溶液（5.2.11）洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹至近干，准确加人1mL1%乙酸溶液（5.2.8），涡旋混合30s，用微孔滤膜（5.2.17)过滤，滤液待测。5.5.3高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C1s柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或性能相当者；a）
流动相：甲醇（5.2.2）十磷酸二氢钾溶液（5.2.12)=25十75；c)
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：230nm；
进样体积：20μL。
5.5.4测定
混合标准系列溶液和试样溶液的测定5.5.4.1
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.2.15）和试样溶液（5.5.2）上机测定。二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶标准溶液的高效液相色谱图见附录B。5.5.4.2定性
以保留时间定性，试样溶液中二甲氧氨嘧啶、三甲氧苄氨啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶保留时间应7
GB/T21037—2024
与标准系列溶液(浓度相当)中二甲氧芋氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶的保留时间一致，其相对偏差在土2.5%之内。5.5.4.3定量
以二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶的质量浓度为横坐标，色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用1%乙酸溶液（5.2.8)稀释后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液的质量浓度相差不超过30%。6试验数据处理
试样中二甲氧芋氨嘧啶、三甲氧芋氨嘧啶和二甲氧甲基莘氨嘧啶含量以质量分数α：计，数值以毫克每千克（mg/kg)表示。多点校准按公式（3)计算；单点校准按公式（4)计算：w -eXVxV,xV.x1000
V2×V.×m×1000
式中：
式中：
由标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL)；净化前复溶后试样溶液体积，单位为毫升（mL)；净化、氮气吹至近干后复溶后试样溶液体积，单位为毫升（mL)；移取上清液体积，单位为毫升（mL）；净化用备用液体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g)；
稀释倍数；
换算系数。
AxVxV.xV,xp.x1000
A.XV2×V.XmX1000
试样溶液的待测物色谱峰面积；试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL)；净化前复溶后试样溶液体积，单位为毫升（mL）；X
净化、氮气吹至近干后复溶后试样溶液体积，单位为毫升（mL)；标准溶液中待测物的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；标准溶液待测物色谱峰面积；
移取上清液体积，单位为毫升（mL)；-净化用备用液体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g)；
稀释倍数；
换算系数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。5.7
精密度
（4）
在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不超过该算术平均值的10%。附录A
（资料性）
GB/T21037—2024
二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧甲基氨嘧啶和dg-三甲氧苄氨嘧啶标准溶液定量离子色谱图
二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧甲基苄氨嘧啶和d9-三甲氧苄氨嘧啶标准溶液的定量离子色谱图见图A.1~图A.4。
二甲氧苄氨嘧啶标准溶液（1ng/mL)定量离子色谱图100
三甲氧苄氨嘧啶标准溶液（1ng/mL)定量离子色谱图9
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