本标准规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致略性试验方法。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致畸作用，检验的对象包括食品添加剂(含营养强化剂)、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。 GB 15193.14-2003 致畸试验 GB15193.14-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.14—2003
代替GB15193.14-1994
2003-09-24发布
Teratogenicity study
2004-05-01实施
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
GB15193.14-2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.14—1994《致畸试验》。本标准与GB15193.14一1994相比主要修改如下：在“范围”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验的对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等：一一在试剂中,，增加了剥皮用的染色液茜素红溶液；一在“实验动物”中：去掉了有关小鼠和兔的内容；在“剂量及分组”中：增加了各剂量组设计的原则要求和急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）无死亡而求不出LDso时的剂量设计方法；一在“操作步骤”中：孕鼠处死和检查中去掉有关小鼠和兔的内容；胎鼠骨标本的制备与检查增加剥皮后的制备方法；增加了“致畸试验应检查的内容和应记录内容”4个表格。自本标准实施之日起，GB15193.14—1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：江医科大学、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：黄幸纤、李悠慧、耿桂英本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订90
1范围
致畸试验
本标准规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致畸性试验方法。GB15193.14-2003
本标适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致畸作用，检验的对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。
2原理
母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎仔畸形。因此，在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时投与受试物，可检出该物质对胎仔的致畸作用。3仪器与试剂
3.1仪器与器材
实验室常用设备、生物显微镜及体视显微镜、游标卡尺（百分尺）。3.2试剂
实验用水为蒸馏水。
3.2.1甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红。3.2.2茜素红贮备液：茜素红饱和液，50%乙酸饱和液5.0mL，甘油10.0mL，1%水合氯醛60.0mL混合，放人棕色瓶中。
3.2.3茜素红应用液：取贮备液3mL～5mL，用1g/100mL～2g/100mL氢氧化钾液稀释至1000mL，存于棕色瓶中。
3.2.4茜素红溶液：茜素红0.1g，氢氧化钾10g，蒸馏水1000mL。（剥皮用染色液）3.2.5透明液A：甘油200mL、氢氧化钾10g，蒸馏水790mL混合。3.2.6透明液B:甘油与蒸馏水等量混合。3.2.7固定液（Bouins液）：2，4，6-三硝基酚（苦味酸饱和液）75份、甲醛20份、冰乙酸5份。实验动物
常用试验动物为大鼠。选用健康、性成熟（90天～100天）大鼠，雌性未交配过的大鼠80只～90只，雄性减半。
5剂量及分组
至少设3个试验组。高剂量原则上应使部分孕鼠（和/或胎鼠）出现毒性作用，如体重减轻等，低剂量组不应引起明显的毒性作用，各剂量组可采用1/4.1/16、1/64LDs。急性毒性试验给予动物受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）无死亡时，以30天喂养试验的最大未观察到有害作用剂量为高剂量组，以下设2个刻量组，另设阴性对照组。对某种新的动物，初次试验可设一阳性对照组。每组至少12只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.5mg/kg体重～1.0mg/kg体重）、五氯酚钠（30mg/kg体重）、阿斯匹林（250mg/kg体重～300mg/kg体重）及维生素A（7500μg/kg体重13000μg/kg体91
GB15193.14-—2003
重)等。
6操作步骤
6.1“受孕动物”的检查和给受试物时间性成熟雌、雄大鼠按1：1（或2：1)同笼后，每日早晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子），认为该鼠已交配，当日作为“受孕”零天。如果5天内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”随机分到各组，并称重和编号，在受孕的第7天～16天，每天经口给予受试物（按0.5mL/100g体重～1.0mL/100g体重计）。受孕的0、7、12、16、20天称体重，并计算给受试物的量。动物交配期室温在20℃～25℃为宜，环境安静，必要时增加麦芽和蛋糕等营养物质。6.2孕鼠处死和检查
于大鼠妊娠第20天直接断头处死。剖腹取出子宫称重，记录并检查吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数。
6.3活胎鼠检查
逐一记录胎仔性别、体重、体长，检查胎鼠外观有无异常。胎鼠体表检查项目见表1。表1致畸试验胎鼠体表检查项目
无脑症
脑膨出
头盖裂
脑积水
小头症
颜面裂
小眼症
眼球突出
无耳症
小耳症
耳低位
小额症
下额裂
口唇裂
6. 4胎鼠骨标本的制作与检查
驱于部
胸骨裂
胸部裂
脊椎裂
脊椎侧弯
脊椎后弯
尿道下裂
无肛门
短尾、卷尾
将每窝1/2的活胎（奇数或偶数）放人95%（体积分数）乙醇中固定2周～3周，取出胎仔流水冲洗数分钟后放人1g/100mL～2g/100mL的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积）8h~72h，透明后放入茜素红-S应用液中染色6h～48h，并轻摇1次/天～2次/天，至头骨染红为宜。再放人透明液A中1天～2天，放人透明液B中2天～3天，待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放人小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）肋骨通常12对～13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎12个～13个，腰椎5个～6个，底椎4个，尾椎3个～5个）有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。
将胎鼠去皮、去内脏及脂肪后，放入茜素红溶液染色，当天摇动玻璃瓶2次～3次，待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换人透明液A中1天～2天，换人透明液B中2天～3天。待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪去，可换置甘油中。（剥皮法）92
胎鼠骨骼检查项目见表2。
脊柱骨
四肢骨
6.5 胎鼠内脏检查
表 2 致畸试验胎鼠骨骼检查项目骨化中心、发育不全
数目、融合、纵裂、部分裂开、骨化中心数、发育不全、缩窄、脱离、形状弓数目、骨化中心数、形状异常、融合、裂开、缩窄、脱离形状、数目
骨化中心数
数目、形状、融合、分叉、缺损、发育不全形状、完全缺损、胸骨节融合、裂开、形状异常、发育不全GB 15193.14—2003
每窝的1/2活胎鼠放入Bouins液中固定2周，作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片在头部横切或纵切共5刀，再部开胸腔和腹腔。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。正常切面见图1。图1大鼠头部正切面图
经口从舌与两口角向枕部横切（切面1），可观察大脑、间脑、正脑，舌及额裂。b）
在眼前面作垂直纵切（切面2），可见鼻部。从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3）。c）
沿头部最大横位处穿过脑作切面（切面4）。以上切面的目的可观察舌裂、双叉舌、颚裂，眼球、鼻畸形、脑和脑室异常。e）沿下水平通过颈部中部作横切面5，可观察气管、食管和延脑或脊髓。以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横瞩膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾孟积水与扩大。试验胎鼠内脏检查项目见表3。
表 3致畸试验胎鼠内脏检查项目头部（脊髓）
嘎球发育不全
侧脑室扩张
第三脑室扩张
无脑症
无眼球症
小眼球症
角膜缺损
单眼球
右位心
房中隔缺损
室间隔缺损
主动脉弓
食道闭锁
气管狭窄
无肺症
多肺症
肺叶融合
气管食管篓
内脏异位
肝分叶异常
肾上腺缺失
多囊肾
马蹄肾
膀胱缺失
睾丸缺失
卵巢缺失
卵巢异位
子宫缺失
子宫发育不全
肾积水
肾缺失
输卵管积水
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6.6试验记录
致畸试验记录内容见表4。
动物交配给受试物期
动物编号
动物种、品系
交配时周龄
确认受孕
临床症状
进食进水量
受试物及溶剂
给样途径
给样期限
7数据处理
表4致畸试验记录内容
解剂检查时
母体解剖所见
卵巢重量
黄体数免费标准bzxz.net
著床数
胎盘重量
胎仔子宫内位置
死胎数
活胎数
胎仔重
胎仔检查
体表检查
骨骼检查
内脏检查
各种率的统计用X检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数、子宫连胎重量用t检验。胎鼠的数据以窝为单位进行统计。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸剂量。为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数。致畸指数一
雌鼠LDao
最小致畸剂量
致畸危害指数二
8结果判定
最大不致畸剂量
最大可能摄人量
...(2)
以致畸指数10以下为不致畸，10～100为致畸，100以上为强致畸。为表示有害物质在食品中存在时人体受害几率，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明该物对人危害小，100～300为中等，小于100为大。
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