DB34/T818—2020
饲料中盐酸克伦特罗的测定
胶体金免疫层析法
代替DB34/T818-2008
Determination of clenbuterol hydrochloride in feeds - Colloid gold immunochromatographic method
发布日期：2020-08-03
实施日期：2020-09-03
发布单位：安徽省市场监督管理局
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准代替DB34/T818-2008《饲料中盐酸克伦特罗的测定—胶体金免疫层析法》，除编辑性修改外主要技术变化如下：
一、修改了标准名称，删除了标准名称中的连接符；
二、修改了范围，明确适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速检测（见第1章）；
三、修改了试剂和材料内容（见第4章）；
四、增加了仪器设备（见第5章）；
五、增加了饲料采样要求（见第6章）和试样制备要求（见7.1）；
六、修改“实验步骤”为“检测步骤”，并修改了部分内容，优化了样品提取（见第7章）；
七、修改了结果判断内容，“方法确认”改为“有效性确认”（见第8章）；
八、修改结果确认方法表述（见第9章）；
九、增加了附录A检测结果判断示意图（见附录A）。
本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。
本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、合肥华盟生物技术有限公司、安徽省公众检验研究院有限公司、安徽华澳生物技术有限公司、宿州市兽药饲料管理站、太湖县小池镇农业农村综合服务中心、铜陵市动物疫病预防与控制中心、铜陵市义安区畜牧兽医局、安徽省水产技术推广总站、宁国市农业产业化发展服务中心。
本标准主要起草人：许世富、李生龙、赵德祥、何学丰、陈文帮、范萍萍、张玉、何为俊、孙德祥、童成亮、刘舜舜、张凯。
1 范围
本标准规定了饲料中盐酸克伦特罗快速检测的胶体金免疫层析法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速检测。本标准检测限为10μg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备
3 原理
本方法采用胶体金竞争抑制法。将氯金酸用枸橼酸钠还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，将样本滴加在胶体金检测条样品垫一端，使液体慢慢向吸水纸另一端渗移。在样本移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的克伦特罗在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上的克伦特罗人工抗原的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显紫红色，结果为阴性。
4 试剂和材料
4.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的二级水。
4.2 胶体金免疫层析快速检测卡组成
4.2.1 盐酸克伦特罗特异性抗体。
4.2.2 胶体金。胶体金溶液采用氯金酸还原法制备，应为带负的紫红色疏水胶体金溶液，金颗粒大小应在30nm~60nm之间。
4.2.3 硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜表面应平整、光滑、白净，没有划痕、小孔、水迹、橘皮状或其他肉眼能见的瑕疵，无灰尘、油渍或其他杂物。硝酸纤维素膜宽度为25.4±0.5mm，长度在100±2mm，厚度在185±19μm，毛细流速度为180±45s/40mm。
4.2.4 聚酯纤维膜。聚酯纤维膜表面形状应为基本均匀的矩形，无明显歪斜现象。色泽好，白色，表面洁净，均匀度好，无破损，无起皱，无污点，无色斑，无霉点，无异味，无杂质及灰尘。聚酯纤维膜重量在98.3±10.0g/m²，厚度在0.42±0.07mm，长度为305.0±2.5mm，宽度为254.0±2.5mm。
4.2.5 吸水纸。
4.2.6 底板。
4.2.7 塑料盒。
4.2.8 塑料吸管。
4.2.9 提取液。
4.3 阴性对照：取不含盐酸克伦特罗的空白样品，作为空白试料。
4.4 阳性对照：取盐酸克伦特罗标准工作液用水稀释为10μg/L。
4.5 盐酸克伦特罗标准品。
4.6 0.1mol/L盐酸溶液：取9mL，加水稀释到1000mL，摇匀。
4.7 0.1mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加水稀释到1000mL，摇匀。
5 仪器设备
5.1 电子天平：感量分别为0.01mg和1mg。
5.2 离心机：≥3000rpm。
5.3 酸度计。
6 采样
按GB/T 14699.1或相关标准规定的方法采样。
7 检测步骤
7.1 试样制备
按GB/T 20195的规定制备试样。
7.2 样品提取
取饲料约0.5g，装入10mL离心管，加提取液1.5mL，浸泡5min~10min，期间振荡2次～3次；静置30min或者离心5min~10min；若样品不为中性，则用0.1mol/L盐酸溶液（4.6）或0.1mol/L氢氧化钠溶液（4.7）调节pH值至7.0±0.1；取上清液备用。
7.3 溶液制备
7.3.1 盐酸克伦特罗储备液：备用，有效期3个月。
7.3.2 盐酸克伦特罗标准工作液：取盐酸克伦特罗储备液，用水稀释至100μg/L，4℃中贮存备用，有效期1个月。
7.4 样品检测
从包装袋中取出盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测卡，置于平整的台面上，检测卡应即开即用。
7.4.2 用塑料吸管（4.2.8）垂直滴加2滴（约60-80μL）无气泡上清液（7.2）于加样孔（S）内，每批需做阴性对照和阳性对照各一个，加样方法同待测样品。
7.4.3 加样后5min时观察结果。
8 结果判断
8.1 有效性确认
8.1.1 阴性对照在检测区（T）出现显色条带，所有阳性对照在检测区（T）均不出现显色条带，且质控区（C）出现一条显色条带，说明检测卡有效，可进行检测。
8.1.2 如阴性对照检测区（T）不出现显色条带，或阳性对照检测区（T）出现显色条带，或质控区（C）未出现一条显色条带，说明检测卡无效，不能进行检测。
8.2 测定结果
8.2.1 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条显色条带，在检测区（T）内无显色条带出现。阳性结果表明：样本中含有盐酸克伦特罗且含量在检测限以上。
8.2.2 阴性（-）：两条显色条带出现。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。阴性结果表明：样本中不含盐酸克伦特罗或其含量在检测限以下。
8.2.3 无效：质控区（C）未出现显色条带，表明本次检测无效（失效原因包括操作过程不当或检测卡已过有效期等）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，更换检测卡重新检测。
9 结果确认
阳性样品应使用色谱质谱联用法进行确认。