WS/T 122-1999 全血中血红蛋白的测定 Quantitative determination of hemoglobin in whole blood 备案号：929-2000 1999-12-09发布 2000-05-01实施 中华人民共和国卫生部发布 前言 全血中血红蛋白测定是一种临床常用试验，需有相应的标准进行规范，本标准因此而制定。本标准从2000年5月1日起实施。本标准由卫生部医政司提出，由解放军总医院临床检验科负责起草。本标准主要起草人：丛玉隆、邓新立。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。 1 范围 本标准规定了全血中血红蛋白测定的方法、结果的表达及氰化高铁血红蛋白标准物。本标准适用于临床实验室的常规检验。 2 定义 本标准采用下列定义。 2.1 高铁血红蛋白 铁原子已被氧化成高铁离子的血红蛋白。可用英文缩写Hi表示。 2.2 氰化高铁血红蛋白 铁原子被氧化成高铁离子，高铁离子已同氰离子相结合的血红蛋白。可用英文缩写HiCN表示。 2.3 总血红蛋白 正常存在人循环血中的所有血红蛋白衍生物，应包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白。 3 检测原理 在溶血液（即溶解血液）中，血红蛋白（硫化血红蛋白除外）中亚铁离子(Fe²⁺)被高铁氰化钾氧化成高铁离子(Fe³⁺)，血红蛋白转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白同氰化钾中的氰离子反应生成氰化高铁血红蛋白。反应应在18～25℃中进行。加入非离子表面活性剂可加快红细胞的溶解，减少脂蛋白沉淀产生的溶液混浊。在仪器上进行测定。氰化高铁血红蛋白在波长540nm左右有一个较宽的吸收峰，它在540nm处的吸光度同它在溶液中的浓度成正比。标本中血红蛋白的浓度可通过先测得吸光度，然后从标准曲线上按吸光度读取。也可以同时与一标准溶液比色而得出结果。 4 材料与装置 4.1 玻璃器材 要求试验中的玻璃器材准确度为A级，清洁度为化学级。微量吸管和沙利氏吸管要求为20μL±0.1μL，吸量管为0.5mL±0.005mL，移液管为5.0mL±0.005mL或10.0mL±0.03mL。容量瓶100mL±0.08mL或1000mL±0.3mL。 4.2 试剂 4.2.1 试剂组成： 氰化钾(KCN) 0.050g 高铁氰化钾[K₃Fe(CN)₆] 0.200g 磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.140g 非离子表面活性剂 0.5mL～1.0mL 加蒸馏水至1000mL。 4.2.2 非离子表面活性剂可用Triton X-100(1mL/L)，Saponic 218等。 4.2.3 试剂应是清亮的淡黄色溶液，不吸收波长大于480nm的光。试剂的pH值在7.0～7.4之间。其用冰点法测量的渗透量应在6～7mmol/L之间。要求血红蛋白在5min内完全转化成氰化高铁血红蛋白。如果试剂变混浊，则应弃去。试剂应避光保存在一容量较大且密封的棕色硼硅玻璃瓶中。试剂应保持新鲜，至少1月配制1次。试剂不可冰冻，否则其中的高铁氰化钾会被破坏，加入乙醇、甲醇、乙二醇或甘油可以防止其分解。 4.2.4 试剂中的氰化钾为剧毒物质，要注意操作安全。 4.3 仪器 使用双波长的分光光度计测量准确，也可使用各种经过校正的光度计和比色计。测量待检标本的血红蛋白浓度，是先测量其在540nm处的吸光度，然后再经过换算所得。仪器必须经过校正。校正的方法是在仪器上测定HiCN标准物，并根据此标准物的光谱特性来对仪器进行调试。校正的主要内容包括： a）工作波长：将标准物放在待测光度计中，从500nm至580nm测量其吸光度，如果最大吸光度在540nm处，则仪器波长准确，否则应对仪器进行调试。在常规工作中，如仪器最大吸光度处的波长在540nm±5nm范围内，也可用此波长作为工作波长，仪器的测量结果也是准确的。 b）校正系数，即k值的测试和计算，见10.4.1（注：原文此处编号可能有误，通常指校正系数相关章节）。 c）检测结果的线性：即检查仪器检测HiCN的吸光度是否同HiCN的浓度成正比。将已知浓度的HiCN标准物准确稀释成各种浓度，分别测定其吸光度。然后以稀释液浓度为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标进行描点，并通过各点作直线。如测试各点均在直线上，则证实仪器的线性良好。如有个别点不在直线上，作直线时应使直线通过尽量多的点，将不在直线上的点的吸光度与所代表的浓度在直线的吸光度比较，如两者之差在5%以内，则可认为仪器的检测线性符合要求。 d）比色杯的厚度及透光性： 1）比色杯的厚度可用标准测量工具进行测量，其结果应精确到0.001cm。 2）透光性测定方法如下：溶解0.2mg伊文兰于100mL蒸馏水中，放入所有待测比色杯内，用一比色杯作标准，将仪器读数准确调到50%透光度，将其他比色杯逐一与标准杯比较，读数时应反复交替测定标准杯与待测杯的透光度，尽量减少仪器漂移的影响，比色杯的透光度应在50%T±0.5%以内方为合格，标记比色杯的透光面，以便在以后应用中使同一侧面面向光源。 5 标本的采集和保存 5.1 血液标本的采集 应使用静脉血，但也可使用外周血。如果用外周血，则要采用正确的标本采集方法。静脉血用乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)抗凝，其比例是1.5mg～1.8mg Na₂EDTA抗凝1mL血液，并要立即混匀。测定应在标本采集后立即进行，也可在一天内测定完毕。在室温(18～25℃)条件下保存标本1周，其中的血红蛋白值变化不大。标本同检测试剂混合后，产生的HiCN溶液更为稳定。如果保存时间超过6h，则应将HiCN溶液放在避光密封的容器中，置于4～10℃条件下。其测量结果可在6年内无改变。 5.2 干扰物质 脂血症或标本中存在的大量脂蛋白产生混浊，白细胞增多及球蛋白增多可造成干扰。煤气中毒或大量吸烟引起血液内碳氧血红蛋白(HbCO)增多，也可引起测量值增高。 6 标本的稀释 按1:251比例稀释血液标本。如果采集的血液用于仪器的标定，则其稀释操作按6.11进行。常规检测标本的稀释按6.1~6.10进行。 6.1 缓慢匀速吸取20μL血液到微量吸管中（不可超过刻度5mm）。 6.2 用一干纱布将微量吸管的外面擦干净，但不可带出微量吸管中的血液。 6.3 调整管中的血液到微量吸管的刻度。 6.4 再用干纱布将微量吸管的外面擦干净。 6.5 将微量吸管中的血液柱轻微地回吸，血液柱的最下端离微量吸管的最下端约10mm。 6.6 将微量吸管插入一个盛有5.0mL试剂的试管中，微量吸管插入液面约2.5cm。 6.7 慢慢地从微量吸管中排出血液标本（血液应扩散到试管的底部）。 6.8 从试管的上部吸取较为清亮的试剂清洗微量吸管8～10次。微量吸管中所有接触过血液的部分都应清洗。 6.9 将试管盖上，倒混匀5～6次。 6.10 稀释过的血红蛋白溶液在室温下放置5min，以保证颜色反应完全。 6.11 大体积的稀释液的制备，在计算稀释倍数之后，可以用0.4mL或0.5mL的吸量管和100mL的容量瓶进行操作。 7 标本的测定 以试剂作空白，在仪器上进行测定，根据仪器对应的曲线读取吸光度。 8 血红蛋白浓度的测定 8.1 根据式(1)计算血红蛋白浓度。 C = (A540 × N × F) / (16114.5 × ε × 1000) 式中： C —— 血红蛋白浓度，g/L； A540 —— 待测血红蛋白溶液在波长为540nm时的吸光度； N —— 血红蛋白单体的分子量，16114.5； F —— 血液的稀释倍数； ε —— HiCN在波长为540nm时的摩尔吸光度； d —— 光径，cm（通常为1.000cm）； 1000 —— 将毫克转换成克所乘的倍数（注：原文公式推导中此处为单位换算系数）。 如果稀释倍数是1:251，光径为1.000cm，则C等于367.7乘以A所得的值。 8.2 如果光度计上的刻度转换成血红蛋白浓度，那么也可在仪器测量的范围内直接读取血红蛋白浓度。 8.3 比色计在同样条件下测定已知浓度的血红蛋白标准液和待检的血红蛋白溶液，可根据式(2)计算出待测血红蛋白溶液的浓度： C = (A540 × Cₛ) / Aₛ₅₄₀ 式中： C —— 待检溶液的血红蛋白浓度，g/L； A540 —— 待检溶液在光波长为540nm时的吸光度； Cₛ —— 标准溶液的血红蛋白浓度，g/L； Aₛ₅₄₀ —— 标准溶液在光波长为540nm时的吸光度。