DB51/T2906-2022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范Technical specification for isolation and identification of swine Gaeta virus 发布单位：四川省市场监督管理局 发布：2022-05-20 实施：2022-07-01 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。由四川省农业农村厅提出，主要起草单位为四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。主要起草人包括陈斌、朱玲、钟攀等。本文件首次发布。 1 范围 本文件规定了猪源盖塔病毒的分离与鉴定方法，适用于猪及其产品中盖塔病毒病原的分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性引用构成本文件必不可少的条款。注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法 - GB19489 实验室生物安全通用要求 - NY/T541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 - BHK-21：乳仓鼠肾源细胞 - CPE：细胞病变 - DMEM：细胞营养液 - DNA marker：DNA相对分子质量标记 - FBS：胎牛血清 - GETV：盖塔病毒 - HEPES：4-羟乙基嗪乙磺酸 - PBS：磷酸缓冲液 - RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 5 试剂与设备 5.1 主要试剂 5.1.1 所用生化试剂均为分析纯。 5.1.2 实验用水应符合GB/T6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。 5.1.3 BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液（1mol/L储存液）、0.01mol/L pH7.0~7.4 PBS（参见附录A）、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×）。 5.2 主要仪器设备 微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。 6 样品的采集、保存与运输 6.1 猪只临床发病特征 新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌变色、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降，以及妊娠母猪出现紧缩障碍综合征等症状时，可认为疑似猪盖塔病毒感染。 6.2 临床样品的采集 采集疑似感染猪的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等组织约2~5g，或血液样品1~2mL。组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中待检。 6.3 保存与运输 样品应按照NY/T541要求包装和运输，尽快送至实验室。样品在2~8℃条件下保存不超过24小时；若超过24小时，应低于-20℃冷冻，不宜反复冻融。 7 病毒的细胞分离培养 7.1 生物安全措施 GETV分离鉴定应在高等级生物安全实验室操作，遵循GB19489规定。 7.2 样品的处理 7.2.1 组织样品 取0.5~1g待检组织，加1~1.5mL PBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青霉素、链霉素的DMEM按3:1 (V/V)稀释。反复冻融三次后，于4℃ 3000r/min离心10分钟，取上清液进行后续操作。