DB34/T3660—2020 鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法
Duplex RT-PCR assay for detection of duck hepatitis virus type 1 and type 3

发布日期：2020-08-03
实施日期：2020-09-03
发布单位：安徽省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、太湖县小池镇农业农村综合服务中心、合肥野生动物园、铜陵市动物疫病预防与控制中心、铜陵市义安区畜牧兽医局。
本标准主要起草人：潘孝成、占松鹤、沈学怀、何学丰、郭长进、范萍萍、尹磊、赵瑞宏、戴银、何为俊、吴娟、胡晓苗、侯宏艳、周学利、张丹俊、周迎春、王军。

1 范围
本标准规定了鸭肝炎病毒1型（DHV-1）和鸭肝炎病毒3型（DHV-3）双重RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于鸭病变肝组织、接种疑似病料的鸭胚尿囊液或细胞培养物中DHV-1型和DHV-3型核酸的检测。

2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DHV：鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus）
RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction）
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
DEPC：二乙基焦磷酸酯（diethyl pyrocarbonate）
Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）
M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus）
PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）
TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（Tris-acetate-EDTA buffer）
EB：溴化乙锭（ethidium bromide）

3 主要仪器
3.1 PCR扩增仪
3.2 台式低温高速离心机（最大离心力1200g以上）
3.3 电泳仪
3.4 凝胶成像系统
3.5 冰箱（-20℃, -80℃）
3.6 微波炉
3.7 分析天平（感量0.01g）
3.8 水浴锅
3.9 微量移液器（2.5μL, 10μL, 200μL, 1000μL）

4 试剂
4.1 RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。
4.2 氯仿、异丙醇、无水乙醇，均为分析纯。
4.3 M-MLV反转录酶。
4.4 RNA酶抑制剂。
4.5 DEPC处理的灭菌水
4.6 Taq DNA聚合酶。
4.7 dNTP。
4.8 DNA分子标准（DNA Marker）。
4.9 RT-PCR反应试剂。
4.10 EB（10μg/μL）或核酸染料。
4.11 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2），见附录A中的A.1。
4.12 50×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。
4.13 1%琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。
4.14 引物：
DHV-1扩增上游引物：5'-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3'；下游引物：5'-TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA-3'；
DHV-3扩增上游引物：5'-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3'；下游引物：5'-ACGAACCAGCCATTGACG-3'；引物浓度均为10 pmol/μL。
4.15 阳性对照样品：DHV-1和DHV-3鸭胚接种尿囊液毒；阴性对照样品：正常鸭胚尿囊液。

5 样品的采集及处理
5.1 采样工具
15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。
5.2 采样与处理
5.2.1 鸭病变肝组织
采取病死或剖杀鸭的肝组织1g左右，按1:5倍体积加入0.01 mol/L pH 7.2 PBS，研磨并经冻融3次，装入15mL灭菌离心管中，8000g离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。
5.2.2 鸭胚尿囊液和细胞培养物
鸭胚尿囊液、细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。

6 RT-PCR检测
6.1 RNA提取
6.1.1 用Trizol或其他商品化RNA提取试剂提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。
6.1.2 200μL的样品和800μL Trizol置于一个1.5mL离心管，反复顺倒混匀，室温静置5min。
6.1.3 12000g, 4℃离心5min，吸取上清液移入新的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min。
6.1.4 12000g, 4℃离心15min，吸取上清液移入新的离心管中（注意不要吸出中间层），加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。
6.1.5 12000g, 4℃离心10min，小心弃去上清液，加入75%乙醇1mL（DEPC水配制）。
6.1.6 12000g, 4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥25min，加入适量DEPC水，-80℃保存备用。

6.2 反转录（cDNA合成）
6.2.1 在PCR反应管中依次加入：OligodT Primer或Random Primers 1μL，dNTPs (10 mmol/L) 1μL，检测样品RNA 3μL，DEPC水 6μL。
6.2.2 在水浴锅或PCR仪中，65℃作用5min，冰上急冷2min。
6.2.3 在上述反应管中再依次加入：5×RT Buffer 4μL，RNase Inhibitor (40U/μL) 0.5μL，M-MLV反转录酶 (200U/μL) 1μL，DEPC水 3.5μL。
6.2.4 在PCR仪中，42℃作用60min，再70℃作用15min，-20℃保存备用。

6.3 PCR反应
6.3.1 PCR反应体系：
10×PCR Buffer 2.5μL，DHV-1和DHV-3上游引物各1μL，DHV-1和DHV-3下游引物各1μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2μL，Taq DNA聚合酶 0.25μL，反转录产物 5μL，灭菌去离子水 11.25μL，总反应体系25μL。
6.3.2 PCR反应条件：
94℃ 5min；94℃ 1min，52℃ 50s，72℃ 1min，循环35次；最后72℃ 10min。

6.4 电泳检测
将PCR扩增产物5μL与2μL上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶板加样孔中，一侧加入DNA Marker，缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳30min左右。电泳后，置于凝胶成像系统下观察，根据DNA分子质量大小（DNA Marker）判断RT-PCR扩增产物大小。

7 结果判定
7.1 当阳性对照在预期大小的位置（720bp和642bp）出现特异性条带，且阴性对照均未出现预期大小的目的条带时，实验结果是成立的。
7.2 被检样品在720bp位置出现特异性条带为DHV-1核酸阳性，在642bp位置出现特异性条带为DHV-3核酸阳性。