DB65/T4669—2023 小反兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提出，由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站。本文件主要起草人：马晓艳、孙雨、王文、刘亚涛、惠志华、王新杰、夏俊、马伟、李舵、苏贵成、苏晓慧、薛文、秦菊、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、马亚珍、符玉涓、艾日登才次克、李璐、张丹、沙那瓦尔塔希、任娟、美热木古丽巴依待拉提、乌那尔汗吉斯汗、孙晓明、冯冰、陈玲、高娜姗、颜成旭、陆桂丽、茹仙古丽木明、加米拉、加伊娜古力、特列克库拉别克。 本文件实施应用中的疑问，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号）、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、中国动物疫病预防控制中心（北京市大兴区天贵大街17号）。 1 范围 本文件规定了小反兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的试剂和引物、仪器用具与耗材、实验步骤、检测结果的判定。适用于新疆小反兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和引物 除规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合GB/T6682的规定执行；pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）溶液配制应符合GB/T27982的规定；DNA/RNA提取相关试剂见附录A，实时荧光PCR检测引物探针见附录B。 5 仪器用具与耗材 需要的仪器设备包括：高速冷冻离心机、电子天平、高通量核酸提取仪、荧光定量PCR仪、-20℃低温冰箱和-80℃超低温冰箱、高通量研磨仪、pH计、高压灭菌锅、生物安全柜、微量振荡器、瞬时离心机、可调移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及无RNA灭菌可调移液器吸头、无RNA灭菌离心管、研磨管、吸附柱等。 6 操作步骤 6.1 样品的采集与存储 6.1.1 拭子样品 选择处于发热期（体温40℃～42℃）的动物进行采样，尽量避免采集治疗中或处于慢性期的动物样本。采样时应佩戴防护手套，避免交叉污染。采集样品后立即放入干冰中保存，运输时使用冷链运输，确保样品在运输过程中不受温度影响。 6.2 核酸提取 使用高通量核酸提取仪提取样本中的DNA/RNA，严格按照操作手册进行操作，确保核酸提取质量。 6.3 PCR反应 根据引物和探针的设计，配制PCR反应体系，并进行实时荧光定量PCR检测。根据PCR曲线的变化情况，判断是否为阳性样本。 7 检测结果的判定 检测结果根据荧光定量PCR曲线进行判定，阳性结果应立即报告，并采取相应的防控措施。