ICS 65.020.20 B44 DB33 浙江省地方标准 DB33/T2246—2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020-03-03发布 2020-04-03实施 浙江省市场监督管理局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：谢荣辉、张传亮、吴赞兹、徐辉、刘霞、周蕾等。 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）荧光定量RT-PCR检测的实验条件、操作步骤及结果判定要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪流行性乙型脑炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病，主要症状为高热、流产、死胎及公猪睾丸炎。 3 实验条件 3.1 仪器设备 包括高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、生物安全柜、组织研磨仪、微量移液器、-20℃冰箱、涡旋混匀器及高压灭菌器等。 3.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，且需使用无RNA酶污染容器分装。 3.2.1 Trizol：RNA提取试剂。 3.2.2 氯仿：4℃预冷备用。 3.2.3 异丙醇：4℃预冷备用。 3.2.4 DEPC水：用于无RNA酶水的制备，经高压灭菌处理。 3.2.5 75%乙醇：用无水乙醇与DEPC水配制并-20℃预冷。 3.2.6 一步法实时荧光RT-PCR试剂（One Step PrimeScript RT-PCR Kit）。 3.2.7 PBS缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.4）。 3.2.8 引物与探针序列： 上游引物：GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT 下游引物：TGCTTTCCATCGGCCYAAAA 探针：FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA 3.2.9 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2株）。 4 操作步骤 4.1 样品采集 4.1.1 脑组织：采集病死猪脑组织，置无菌离心管中编号，冷藏送检或-20℃以下保存。 4.1.2 全血：静脉采血后置无菌管保存，冷藏送检；血清需分离后-20℃保存。 4.2 样品处理 4.2.1 脑组织样品按1:10加入PBS后研磨，反复冻融3次，10000 r/min离心5 min取上清备用。 4.2.2 全血样品3500 r/min离心5 min，取血清备用。 4.3 RNA提取 4.3.1 可采用Trizol法或商品化RNA提取试剂盒。 4.3.2 设置样品、阳性对照及阴性对照。 4.3.3 加Trizol后震荡混匀，加入氯仿，4℃12000 r/min离心15 min分离。 4.3.4 （原文后续内容未完整识别）