ICS 11.020 G51 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB45/T 2138—2020 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光RT-PCR法 Detection of norovirus nucleotide acid in water - Real-time RT-PCR 2020-07-24 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 发布 2020-08-20 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并归口。 本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宁燕、钟革、李秀桂。 1 范围 本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水及污水等水体中诺如病毒基因组I（GI）和基因组II（GII）的检测。 2 术语和定义 2.1 诺如病毒（Norovirus） 诺如病毒是引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体，多通过饮用水或生活用水污染导致水源性暴发疫情。诺如病毒属于杯状病毒科，为无包膜、单股正链RNA病毒，直径约26 nm～35 nm，表面呈粗糙球形对称结构。根据基因特征，诺如病毒分为多个基因组，其中GI和GII是引起人类急性胃肠炎的主要基因组，GIV也可感染人类，但较少检出。 2.2 实时荧光逆转录PCR（Real-time RT-PCR） 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测扩增过程，对模板进行定性或定量分析的方法。 2.3 Ct值（Cycle threshold value） 每个PCR反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。起始拷贝数越多，Ct值越小，二者呈线性关系。 3 原理 水样通过带负电荷的混合纤维素膜过滤后，病毒颗粒被吸附在膜上，经洗脱后用聚乙二醇沉淀法对病毒进行富集浓缩。随后采用实时荧光RT-PCR方法检测诺如病毒。 在扩增体系中以诺如病毒衣壳蛋白区（N/S区）设计特异性引物和探针，荧光探针5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团。完整探针时荧光被淬灭；PCR扩增过程中，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针水解，报告荧光释放并被检测系统采集，从而实现荧光信号与扩增产物同步增长。 4 试剂和耗材 4.1 试剂 4.1.1 除另有说明外，本文件所用试剂均为分析纯，分子生物学试剂用水应符合无RNA酶水要求。