ICS 65.020 B16 DB37 山东省地方标准 DB37/T 3893—2020 芋头病毒检测技术规程 Detection and identification of taro viruses 2020-03-31 发布 2020-05-01 实施 发布单位：山东省市场监督管理局 前言 本标准由山东省农业农村厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。 1 范围 本标准规定了芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RT-PCR检测方法。 本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 检测对象 3.1 芋花叶病毒 中文名：芋花叶病毒 学名：Dasheen mosaic virus 缩写：DsMV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750 nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。 3.2 黄瓜花叶病毒 中文名：黄瓜花叶病毒 学名：Cucumber mosaic virus 缩写：CMV 分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径约为28 nm～30 nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播，导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。 4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备和用具 主要包括：PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、纯水仪、万分之一天平、普通冰箱（0 ℃～4 ℃）、-20 ℃低温冰箱、-70 ℃低温冰箱、磁力搅拌器、高压灭菌锅、可调微量移液器（10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL、5000 μL）、RNase-free吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）、RNase-free离心管（1.5 mL、2.0 mL）、RNase-free PCR反应管。 4.2 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A。除特殊说明外，实验用水应符合GB/T 6682要求，为无菌超纯水或去离子水。 4.2.1 RNA提取试剂 包括：多糖多酚植物RNA提取试剂盒或其他等效产品、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、RNase-free超纯水。 4.2.2 反转录试剂 包括：随机引物、RNase抑制剂、逆转录酶（AMV或其他等效酶）、dNTPs（10 mM），-20 ℃贮藏。 4.2.3 PCR试剂 包括：DNA聚合酶试剂盒（2× Es Taq MasterMix或其他等效产品）、核酸染料（GelRed 10000×溶液或其他等效溶液）、含10倍浓度GelRed的1%琼脂糖凝胶、6×DNA上样缓冲液。 5 RT-PCR检测方法 5.1 方法提要 芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒均为RNA病毒，利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。 5.2 样品采集 观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状。采集出现上述症状的样品，装入无菌样品袋中，标记样品编号、取样时间和取样地点，于低温条件（2 ℃～8 ℃）运送至实验室，并置于-70 ℃超低温冰箱保存备用。样品应避免反复冻融。 以经分子检测不含病毒的样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品作为阳性对照。以下操作对阴性对照和阳性对照进行同样处理。 5.3 RNA的提取和纯化