DB35/T1354-2013 罗非鱼无乳链球菌病双重PCR诊断规程 2013-08-01发布 2013-11-01实施 福建省质量技术监督局发布 前言 本标准的某些内容可能涉及专利，发布机构不承担专利识别责任。本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。由福建省海洋与渔业厅提出并归口，起草单位为福建省淡水水产研究所和顺昌县水产技术推广站。主要起草人包括樊海平、吴斌、张新艳、邓志武、郑磊、钟全福、曾占壮。 1 范围 本标准规定了罗非鱼无乳链球菌病的术语和定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、双重PCR检测和诊断。本标准适用于罗非鱼无乳链球菌病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用必不可少。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；不注日期的文件，其最新版本（包括所有修改单）适用：SC/T7014-2006《水生动物检疫实验技术规范》、SC/T7103-2008《水生动物产地检疫采样技术规范》、SC/T7202.2-2007《斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法》。 3 术语和定义 3.1 罗非鱼无乳链球菌病 罗非鱼受无乳链球菌感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。 4 试剂与溶液 4.1 无乳链球菌16S rRNA基因部分序列引物：F1 5'-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3'，浓度10μmol/L，-20℃保存；R1 5'-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3'，浓度10μmol/L，-20℃保存。 4.2 无乳链球菌sip（表面免疫相关蛋白）基因序列引物：F2 5'-ATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3'，浓度10μmol/L，-20℃保存；R2 5'-TTATTTGTTAAATGATACGTGAACA-3'，浓度10μmol/L，-20℃保存。 4.3 溶菌酶（100 μg/mL）：生化试剂，-20℃保存。 4.4 蛋白酶K（100 μg/mL）、NaCl（3 mol/L）、裂解缓冲液和SYBR Green I工作液按附录A规定配制。 4.5 DNA分子量标准（0.1 kb～1.5 kb）：生化试剂，-20℃保存。 4.6 阳性对照：无乳链球菌标准株的DNA模板，-20℃保存。 4.7 阴性对照：已知无乳链球菌阴性的罗非鱼组织样品DNA模板，-20℃保存。 4.8 空白对照：无菌双蒸水。