HG 3618-1999 苏云金杆菌悬浮剂 HG3618-1999 标准下载解压密码：www.bzxz.net

HG3618—1999
本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的本标准对苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位：中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位：湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人：刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王绮文。1172
中华人民共和国化工行业标准
苏云金杆菌悬浮剂
Bacillus thuringiensis suspension concentrateHG 3618--1999
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000。1范围
本标准规定了苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂制成的苏云金杆菌悬浮剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1250—1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1601—1993农药pH值的测定方法GB/T1604-—1995商品农药验收规则GB/T1605—1979（1989）商品农药采样方法GB3796—1983农药包装通则
GB/T148251993农药可湿性粉剂悬浮率测定方法GB/T16150—1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法HG3617—1999苏云金杆菌原粉
3要求
3.1外观：棕黄色至褐色悬浮液体。3.2苏云金杆菌悬浮剂还应符合表1要求。表1苏云金杆菌悬浮剂控制项目指标项
毒素蛋白，%
毒力效价([Px IU /μLJ[Ha IU/μLJ)pH值范围
细度(150 μm),%
悬浮率(有效成分),%
8 000 IU/μLbzxZ.net
4 000IU/μL
注： Px 和 Ha 分别为小莱蛾(Plutella xylostella)和棉铃虫(Heliothis armigera)的缩写。国家石油和化学工业局1999-06-16批准2 000IU/μL
2000-06-01实施
4试验方法
HG 3618-1999
除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样
按照GB/T1605-1979（1989）中第四章“乳剂和液体状态的采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量应不少于250mL。4.2鉴别试验
当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，并同时测定毒素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。4.3毒素蛋白含量的测定
毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1SDS-PAGE-扫描法（仲裁法）4.3.1.1方法提要
用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。
4.3.1.2仪器、设备
电泳仪。
夹芯式垂直电泳槽（1.5mm凹形带槽橡胶模框）、凝胶板面积145mm×100mm（1.5mm、12孔样品槽模具）。
高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机：10000r/min。
分析天平：精确至0.0001g。
4.3.1.3试剂和溶液
过硫酸铵（AP）。
十二烷基硫酸钠(SDS)。
四甲基乙二胺（TEMED)。
氢氧化钠。
30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺30g，亚甲基双丙烯酰胺（原称：甲叉双丙烯酰胺)0.8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。1 mol/L、pH8.8 三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷 30.25 g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸罐水定容至250mL。1 mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl 缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷12.10 g溶于蒸水中，用浓盐酸调至pH6.8,用蒸馏水定容至100mL。电极缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
3×样品稀释液：1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl18.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL，巯基乙醇15mL，少许溴酚蓝，用蒸馏水定容至100mL。染色液：称取考马斯亮蓝（CBB)R-2501g，加人甲醇450mL，冰乙酸100mL，蒸馏水450mL，溶解过滤后使用。
脱色液：量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馏水定容至1000mL。1174
HG 3618-- 1999
漂洗液：量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸馏水60mL，混合均勾后使用。毒素蛋白标样：毒素蛋白（相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4.3.1.4试样处理
称取标样20mg（准确至0.1mg），移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。量取待测试样10mL，准确称量后，用蒸馏水定容至100mL，充分摇匀后取2mL稀释液，移至5 mL离心管中。
在上述2ml.试样溶液中加入0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL（使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置约5min，再加人3×样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100℃沸蒸馏水中煮6min，离心（2000r/min)10min后取上层清液，以备电泳上样。4.3.1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白
a）制备8%~10%聚丙烯酰胺凝胶
采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616一1999附录A（提示的附录）。b）上样
取上述标样溶液上层清液，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6.8、10、12、14μL(毒索蛋白含量约为3～7μg），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为5 μg），加人到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c）电泳
电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1 cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积百分数)的乙酸中浸泡30min。d）染色
将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e）脱色
倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。
4.3.1.6测定
胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nm。
样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X=mV
式中：ml—从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量，μg；m22 mL稀释液中样品的质量,mg;V,--样品最终定容体积，mL(3.75mL)；V2——注人凝胶上样孔的样品体积，uL。4.3.1.7允许差
取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2SDS-PAGE-洗脱比色法
4.3.2.1方法提要
+*（1)
用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2仪器
分光光度计。
其他同4.3.1.2。
4.3.2.3试剂和溶液
吡啶。
其他同4.3.1.3。
4.3.2.4试样处理
同4.3.1.4。
4.3.2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白
a）制备8%~10%聚丙烯酰胺凝胶
同4.3.1.5a）。
b）上样
HG 3618—1999
取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15、20、30、40、50μL（毒素蛋白含量约为7.5～25ug），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为15μg），加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c）电泳
同4.3.1.5c）。
d）染色
同4.3.1.5d)。
e）脱色
同4.3.1.5e)。
4.3.2.6测定
用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试管中，再加25%吡啶（体积百分数）3.0mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考马斯亮蓝(CBB)R-250,平衡后用分光光度计，以25%吡啶为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式（1)计算毒素蛋白含量。4.3.2.7允许差
取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.4毒力效价的测定
按 HG 3616—1999附录 B(标准的附录)进行。4.5pH值的测定
按GB/T1601进行。
4.6悬浮率测定
4.6.1测定步骤
样品播匀后取5.00mL（精确到0.01mL），于100mL三角玻璃瓶中，加入标准硬水100mL，用手左右振荡50次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量简中，用标准硬水稀释到250mL。按GB/T14825—1993中3.1进行。
4.6.2计算
悬浮率(Y)按式(2)进行计算：
Y = 111.1(C - Q)
式中：C—-配置悬浮液所取试样的毒力效价,IU;Q——留在量简底部的25mL恶浮液的毒力效价，IU。4.6.3允许差
二次重复测定结果之差不得超过10%。4.7细度的测定
吸20.00mL试样（准确至0.01mL），按GB/T16150-1995中2.2进行。1176
（2）
5检验规则
HG3618-1999
应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6标志、标签、包装、贮运
6.1产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2悬浮剂产品主要采用1L塑料壶包装，壶有内外盖，不泄漏。6.3贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉于燥处。6.4运输时，注意轻放，防止损坏。6.5保证期：在正常运条件下，悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为一年半，本产品出厂时毒力效价且蛋白含量不低于3.2指标，年半内毒力效价与蛋白含量均不低于3.2指标的60%。1177
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