DB15/T1517—2018 从红豆草中提取纯化缩合单宁的方法（Method for Extraction and Purification of Condensed Tannins from Sainfoin (Onobrychis vicifolia Scop.)） 发布单位：内蒙古自治区市场监督管理局 发布日期：2018-12-20 实施日期：2019-03-20 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规则起草，由内蒙古自治区农牧业科学院提出，并由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。起草单位包括内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所、中国农业科学院草原研究所。起草人：刘秀丽、侯勇跃、李锋、裴乐、李元恒、卢岩、阿木古楞。 1 范围 本标准规定了从红豆草中提取和纯化缩合单宁的方法，适用于实验室研究和提取阶段的中型试验。 2 规范性引用文件 下列文件对本标准的应用必不可少： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T 15686 高粱单宁含量的测定 注：凡注日期的引用文件，其所注版本适用；未注日期者，采用最新版本，包括所有修改单。 3 术语和定义 3.1 单宁（tannins） 植物以碳为基础的复杂酚类次生代谢产物，分子量在500～3000 Da，普遍存在于植物茎、叶、树皮、花和种子的细胞壁及液泡中。 3.2 缩合单宁（condensed tannin, CT） 又称原花青素，由黄烷-3-醇通过碳-碳双键连接形成的缩合物。 3.3 提取（extraction） 通过选择适当溶剂和方法，将目标成分从原材料中分离的过程。本方法利用相似相溶原理，通过有机溶液浸提法将红豆草中的缩合单宁分离。 3.4 纯化（purification） 利用凝胶过滤法，根据分子筛原理按分子物质大小进行分离。 3.5 凝胶活化（gel activation） 将干燥的商品凝胶颗粒在使用前于洗脱液中浸泡溶胀。 3.6 凝胶过滤（gel filtration） 利用凝胶三维网状结构的分子筛过滤作用，根据分子量大小分离化合物。 4 材料与试剂 4.1 材料 红豆草（Onobrychis viciifolia Scop.）：缩合单宁主要集中在叶片中，随着物候期成熟含量下降，建议采集孕蕾期，人工齐地割收，置于保温箱内。 4.2 试剂 4.2.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T 6682三级水要求。 4.2.2 丙酮 4.2.3 无水乙醇 4.2.4 抗坏血酸 4.2.5 乙醚 4.2.6 葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20（吸水率2.5 mL/g） 5 仪器与设备 5.1 旋转蒸发仪（转速20～280 rpm，温度室温±5℃～180℃） 5.2 真空冷冻干燥机（冷阱温度可达-50℃，FreeZone 2.5 liter, LABCONCO） 5.3 氮气吹干仪（水浴式，温度室温±5℃～100℃） 5.4 磁力搅拌器（转速0～1000 rpm） 5.5 天平（精度0.01 g，0.0001 g） 5.6 旋涡混浊仪 5.7 高速冷冻离心机（温度≤4℃） 5.8 水浴锅（温度室温±5℃～100℃） 5.9 粉碎机（筛孔径1 mm） 5.10 可调移液器（0.5 mL～5 mL，1 mL～10 mL） 5.11 真空泵 5.12 布氏漏斗（200 mL，直径90 mm，带磨口三角瓶及真空泵接口） 5.13 聚乙烯离心管（5 mL、50 mL） 6 材料的准备 将采集的红豆草剪碎成1～5 cm的小段，置于带孔保鲜袋中，放入-50℃真空冷冻干燥机冻干。取出后用1 mm孔径粉碎机粉碎成粉末，避光保存。 7 溶液的配制 7.1 70%丙酮溶液 准确量取丙酮700 mL，加水定容至1000 mL，摇匀，即得1 L 70%丙酮溶液。