DB22/T1828—2013 农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测
Detection of Salmonella, Shigella and Staphylococcus aureus in agricultural products by multiplex PCR method
发布日期：2013-05-15
实施日期：2013-09-01
发布单位：吉林省质量技术监督局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001起草，由吉林省质量技术监督局提出并归口。起草单位包括吉林省产品质量监督检验院和吉林农业大学。主要起草人：郦炜、陈萍、史艳宇、李月红、任常菲、王秀娟、崔敬爱。

1 范围
本标准规定了农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌核酸的多重PCR检测方法，适用于农产品中这些病原菌的快速筛选检测，但不适用于仲裁检验。

2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用必不可少。注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用：
- GB 4789.4 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
- GB 4789.5 食品微生物学检验 志贺氏菌检验
- GB 4789.10 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
- GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
- GB 19489 实验室生物安全通用要求
- WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

3 术语和定义
3.1 多重聚合酶链式反应（多重PCR）
多重PCR又称多重引物PCR，是在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增多个核酸片段的PCR反应。

4 缩略语
本标准使用的主要缩略语包括：
- imvA基因：侵袭蛋白基因（invasion protein A gene）
- nuc基因：耐热核酸酶基因（thermo-stable nuclease gene）
- ipaH基因：侵袭性质粒抗原基因（invasive plasmid antigen H gene）

5 试剂
除特别说明外，所用试剂为分析纯或生化试剂。
5.1 水：符合GB/T 6682一级水规格。
5.2 缓冲蛋白陈水（BPW）：按GB 4789.4规定。
5.3 7.5%氯化钠增菌肉汤：按GB 4789.10规定。
5.4 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：按GB 4789.5规定。
5.5 引物：见表1。

表1 引物序列
| 致病菌名称 | 靶基因 | 上下游引物序列 | 产物长度 (bp) | 终浓度 (mmol/L) |
|---|---|---|---|---|
| 沙门氏菌 | invA | -GTCATGATATTCCGCCCCATATT-3
-CGGTGCGATGAAGTTTATCAAAG-3 | 255 | 40 |
| 金黄色葡萄球菌 | nuc | -GCTCAGCAAATGCATCACAAAC-3
-AGCGTTGTCTTCCGCTCCAAA-3 | 506 | 40 |
| 志贺氏菌 | ipaH | -GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3
-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3 | 620 | 120 |

5.6 细菌基因组DNA提取试剂盒
5.7 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200 mmol/L 氯化钾，20 mmol/L 氯化镁，dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
5.8 Taq DNA聚合酶
5.9 分子量标记：100 bp DNA Marker；琼脂糖：电泳纯；溴化乙锭；50×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484 g Tris，114 mL冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，定容至2 L，分装高压灭菌备用，使用前稀释成1×TAE工作液。
5.10 6×加样缓冲液：30 mmol/L EDTA、36%甘油、0.05%二甲苯腈蓝FF、0.05%溴酚蓝。
5.11 阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌标准菌株。
5.12 阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。

6 设备和材料
本标准所用设备及材料应满足实验室生物安全及PCR操作要求。