DB65/T3597-2014
生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程
PCR of technical protocol for detection of Brucella in raw milk
新疆维吾尔自治区地方标准
发布日期：2014-03-01
实施日期：2014-05-01
发布单位：新疆维吾尔自治区质量技术监督局

前言
DB65/T3597-2014
本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规则起草。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。
本标准起草单位：新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所、新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院、新疆农业大学动物医学学院。
本标准起草人：易新萍、钟旗、高帅、姚刚、马晓菁、叶锋、谷文喜、叶尔洪·努尔、刘丽娅。

1 范围
本标准规定了检测生鲜乳中布鲁氏菌病原分离的术语、定义和缩略语、仪器、设备和试剂、生物安全措施、防污措施、检验方法的要求。本标准适用于生鲜乳中布鲁氏菌的分离及鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 1467-2007 奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术
SN/T 1942.1-2007 进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法 第1部分：分离与计数方法
SN/T 1942.2-2007 进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法 第2部分：PCR检验方法
WS 269-2007 布鲁氏菌病诊断标准
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶反应技术的应用

3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1.1 布鲁氏菌（Brucella）
布鲁氏菌是革兰氏阴性、细小杆状菌，为小球杆状菌，能引起人及多种动物的急性和慢性感染。
3.1.2 生鲜乳（Raw milk）
指奶畜乳房中挤出的未经任何处理的乳汁。
3.1.3 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。
3.1.4 引物（Primer）
应用化学方法合成一对与已知扩增基因片段两侧DNA序列互补的寡核苷酸，作为PCR扩增的片段。
3.1.5 模板（Template）
待扩增的靶DNA或RNA链。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
3.2.1 PCR：聚合酶链反应
3.2.2 DNA：脱氧核糖核酸
3.2.3 PCR mix：聚合酶链反应混合物
3.2.4 EB：溴化乙锭
3.2.5 ddH2O：灭菌双蒸水
3.2.6 TAE：电泳缓冲液

4 仪器、设备和试剂
4.1 仪器和设备
4.1.1 培养皿：直径90mm
4.1.2 “L”型玻璃涂布棒
4.1.3 接种环：直径3mm
4.1.4 天平：量程0kg，感量：0.1g
4.1.5 CO2培养箱及常规恒温培养箱
4.1.6 灭菌处理器具：1.5mL高心管、0.2mL PCR反应管、微量移液器Tip头、50mL带盖塑料管
4.1.7 PCR扩增仪
4.1.8 可调微量移液器（10-1000μL）
4.1.9 电泳仪
4.1.10 紫外凝胶成像仪
4.1.11 显微镜
4.2 试剂
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。
4.2.1 布氏琼脂培养基（见附录A）
4.2.2 布鲁氏菌选择添加剂（见附录A）
4.2.3 1X TAE电泳缓冲液（见附录A）
4.2.4 革兰氏染色液
4.2.5 0.85%灭菌生理盐水
4.2.6 PCR mix（含Taq酶、dNTP、PCR buffer、Mg2+、上样缓冲液）
4.2.7 鉴定布鲁氏菌引物：
VirB-8 (F) 5'-ATGTTTGGACGCAAACAATCTC-3’
VirB-8 (R) 5'-TCATTGCACCACTCCCATTTCT-3’
引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成浓度为10μmol/L。预计扩增目的片段719bp。
4.2.8 质控菌株（使用以下一种即可）：灭活的布鲁氏菌标准株（如牛种布鲁氏菌A19、羊种布鲁氏菌M5和16M、猪种布鲁氏菌S2等）
4.2.9 琼脂糖

5 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置，应按照GB 19489中的有关规定执行。

6 防污措施
参照WS/T 230-2002中第6部分进行污染的预防和控制。

7 检验方法
7.1 样品准备
采集哺乳动物新鲜原乳约10mL。
7.2 检验程序见图1。
7.3 检验步骤
7.3.1 布鲁氏菌分离培养
将冻融的生鲜乳混匀，用移液器取300μL生鲜乳接种于含布鲁氏菌添加剂的布氏琼脂平板培养基上，分别置于有氧条件和含（5~10)%二氧化碳的培养箱中，37℃培养，3d后观察菌落生长情况。按表1观察菌落形态，做革兰氏染色并镜检。
7.3.2 染色及镜检
在上述平板上挑取疑似布鲁氏菌进行革兰氏染色并镜检。布鲁氏菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，呈红色，无运动性、无鞭毛、无荚膜，一般不形成芽孢，涂片多散在，边缘稍圆或直。