ICS 67.100.01 X16 标准号：DB37/T3532-2019 标题：羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 发布：2019-03-21 实施：2019-04-21 发布机构：山东省市场监督管理局 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009起草，由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，归口山东省畜牧专业标准化技术委员会。起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。主要起草人：胡悦、范阳阳、刘艳艳、张全芳、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕。 1 范围 本标准规定了羊奶产品中羊、牛源性成分的实时荧光定性PCR检测方法，适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶及羊奶粉等羊奶制品。检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件对本标准的应用是必不可少的： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T 27403 实验室质量控制规范 - 食品分子生物学检测 3 术语和定义 3.1 羊源性：本标准所指羊源性成分为山羊和绵羊。 3.2 实时荧光PCR（real-time fluorescence PCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监控PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.3 Ct值（cycle threshold）：PCR反应达到阈值的循环次数。 4 原理 根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间的保守区设计通用引物，在可变区设计特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增。根据荧光信号及循环阈值判定羊和牛源性成分。 5 试剂和材料 除另有说明外，分析中使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682的一级水。 5.1 试剂 - 氯化钠（NaCl） - 浓盐酸（HCl） - 三羟甲基氨基甲烷（Tris base） - 二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O） - 十二烷基硫酸钠（SDS） - 磷酸盐缓冲液（PBS） - 异硫氰酸胍（GuSCN） - 硅珠（silica） - 蛋白酶冻干品 - 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100） - 无水乙醇 - Chelex-100树脂 5.2 材料 - 生理盐水：0.85g氯化钠溶解于20mL水，转入100mL容量瓶，加水定容，121℃蒸汽灭菌20min，4℃保存。 - 20mg/mL蛋白酶K溶液：0.2g蛋白酶冻干品溶于10mL水，分装于-20℃保存。 - 5% Chelex-100：5g Chelex-100树脂溶于100mL水。 - 1 mol/L Tris-HCl (pH6.4)：12.1g三羟甲基氨基甲烷溶于100mL水，用浓盐酸调节pH至6.4，121℃蒸汽灭菌20min，室温保存。 - 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)：18.61g二水乙二胺四乙酸二钠溶于100mL水，用10%氢氧化钠调节pH至8.0。