ICS11.220 B41 DB34 DB34/T1891-2013 活毒疫苗中禽白血病病毒污染检测技术规程 安徽省质量技术监督局 发布信息： 发布日期：2013-05-10 实施日期：2013-06-10 起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 主要起草人：胡晓苗、张丹俊、侯宏艳、潘孝成、赵瑞宏、戴银、周学利、刘慧芳、沈学怀、朱传民 前言： 本标准按照GB/T1.1-2009起草。鸡白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒（ALV）引起的鸡的传染性肿瘤疾病，以垂直传播为主，也可水平传播，是鸡的重要种源性免疫抑制病之一。近年来，鸡白血病流行日趋严重，活毒疫苗的污染是引起传播的重要因素。检测活毒疫苗中ALV污染对防控鸡白血病具有重要意义。 本规程依据《中华人民共和国动物防疫法》及相关法规制定，由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出，归口于安徽省农业标准化技术委员会。 1 范围 本标准规定了活毒疫苗中ALV污染的ELISA和PCR检测技术，适用于活毒疫苗中ALV污染的检测。 2 规范性引用文件 本标准引用下列文件，其内容对本标准实施必不可少： - DB34/T1891-2013 - NY/T680-2003 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法 - 中华人民共和国动物防疫法 3 弱毒疫苗的稀释方法 取1000羽份冻干疫苗1瓶，加2毫升灭菌生理盐水稀释，使100微升中含疫苗50羽份。取100微升稀释液进行ELISA检测，取200微升稀释液提取DNA用于PCR检测。 4 检测方法 4.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 按NY/T680-2003要求进行，试验成立条件作适当修改：阳性对照OD均值减去阴性对照OD均值大于0.20时试验成立，否则重做。可选择市售p27抗原ELISA检测试剂盒完成疫苗p27抗原检测。 4.2 聚合酶链式反应（PCR）检测 4.2.1 材料 Taq酶、dNTP、DNA Marker、琼脂糖、细胞裂解液、酚、氯仿、异戊醇、ddH2O、75%乙醇、特异性引物、PCR仪、高速台式冷冻离心机（最大转速16000 rpm）、冰箱、水浴锅、微量移液器、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪。 4.2.2 操作方法 4.2.2.1 DNA的提取 阳性对照与样品同时提取DNA，实验使用灭菌超纯水作为阴性对照。取疫苗稀释液和细胞裂解液各200微升加入1.5 mL离心管中，加蛋白酶K 10微升（2 mg/mL），颠倒混匀后进行后续DNA提取操作。