ICS65.020.30 B43 DB12 天津市地方标准 DB12/T956—2020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia Coli in dairy farm manure - Enzyme substrate method 2020-08-18发布 2020-10-01实施 天津市市场监督管理委员会发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所。本标准主要起草人：赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨。 1 范围 本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技术要求及操作方法。本标准适用于规模化奶牛场粪污中上述三类微生物的同时测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期版本适用；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用。 GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27522—2011 畜禽养殖污水采样技术规范 HJ1001—2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定 酶底物法 3 术语和定义 HJ1001—2018及以下术语适用于本文件。 3.1 总大肠菌群和粪大肠菌群 奶牛场粪污中常见肠杆菌科细菌，在37℃（总大肠菌群）或44.5℃（粪大肠菌群）培养条件下，可分解邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色邻硝基苯酚。 3.2 大肠埃希氏菌（Escherichia Coli） 俗称大肠杆菌，在37℃培养下可分解ONPG生成邻硝基苯酚，同时可分解MUG释放4-甲基伞形酮，在365nm紫外光照射下显蓝色。 3.3 最大可能数（MPN） 一种基于泊松分布的间接计数方法，根据不同稀释度样品培养后的阳性结果，查表估算目标微生物数量。 4 粪污样品采集 4.1 采样物品 采样容器应使用一次性无菌容器或经121℃、20min高压灭菌处理的容器。其他工具按GB/T27522—2011规定执行。 4.2 采样方法 按GB/T27522—2011相关规定执行。 4.3 样品保存 采样后应在4℃条件下保存，并在6h内完成测定。 5 酶底物测定 5.1 方法原理 样品在选择性培养基中培养18h～24h，总大肠菌群和粪大肠菌群分解ONPG生成黄色产物；大肠埃希氏菌分解MUG释放4-甲基伞形酮，在紫外光下呈蓝色。通过97孔板阳性反应数，查MPN表计算微生物浓度。 5.2 试剂材料 5.2.1 实验用水应符合GB/T6682—2008三级水要求，并经121℃、20min灭菌后使用。 5.2.2 培养基采用HJ1001—2018规定的Minimal Medium ONPG-MUG培养基，每100mL样品使用培养基粉末2.7g±0.5g。培养基可为商品化制品，其主要成分包括硫酸铵、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、两性霉素B、ONPG及MUG等。