DB12/T952—2020 猪粪中抗生素残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法
The determination method of antibiotic residues in pig manure by liquid chromatography-mass spectrometry

发布日期：2020-08-18
实施日期：2020-10-01
发布机构：天津市市场监督管理委员会

前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、天津农学院。本标准主要起草人：支苏丽、张克强、周婧、刘海学、吴惠惠、杜连柱、阮蓉。

1 范围
本标准规定了猪粪中抗生素检测的原理、试剂耗材、仪器设备、试样制备、检测步骤、结果计算和精密度。本标准适用于生猪养殖场畜舍内以及堆粪场粪便中土霉素、强力霉素、四环素、去甲基金霉素、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、氟罗沙星、奥比沙星、氟甲喹、西诺沙星和依诺沙星残留量的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T1896-2010 兽药残留实验室质量控制规范

3 原理
样品中抗生素残留物用甲醇-乙腈-柠檬酸缓冲溶液提取，用固相萃取小柱净化，用液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。

4 试剂材料
4.1 水：GB/T6682规定的一级水。
4.2 乙腈：色谱级。
4.3 甲醇：色谱级。
4.4 甲酸：色谱级。
4.5 EDTA-柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸12.8和磷酸二钠5.45g，乙二胺四乙酸二钠37.2g溶于水中，并稀释至1L。
4.6 0.1%甲酸溶液：取甲酸（4.4）0.5mL溶于水稀释至500mL，当天配制。
4.7 标准储备溶液：分别称取适量标准品（精确到0.00001g），分别用甲醇（4.3）溶解，配制成100mg/L，置于冰箱-20℃保存，保质期6个月。
4.8 标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液（4.7）适量，用甲醇：水（V/v=50：50）配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（用时现配）。
4.9 Oasis HLB固相萃取小柱或者相当：6mL，500mg。
4.10 滤膜：0.22μm，有机系。

5 仪器设备
5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI源）。
5.2 分析天平：感量0.00001g和0.01g。
5.3 旋涡混匀器。
5.4 超声波发生器。
5.5 离心机：最大转速不低于5000r/min。
5.6 移液器。
5.7 固相萃取装置。
5.8 氮气吹干仪。
5.9 冷冻干燥器。

6 试样制备
取适量样品，将充分的样品进行冷冻干燥并粉碎，粉碎后装入洁净容器，并于-18℃避光干燥保存。

7 检测步骤
7.1 提取
称取1.00g（精确到0.01g）干燥猪粪样于50mL离心管中，加入10mL乙腈-甲醇-EDTA-柠檬酸缓冲液（1:1:2，v/v/v）混合液，涡旋1.0min，100Hz超声15min，4℃离心（10000r/min）15min。将上清液吸取到烧杯中，再重复提取一次，将上清液合并，进行适当稀释至有机相低于10%。
7.2 净化
首先用6mL甲醇和6mL水，依次活化固相萃取柱。将稀释过的上清液混匀，以大约1mL/min的速度通过活化后的HLB固相萃取柱。待过完柱子后，用6mL水淋洗，真空抽干柱子，用6mL甲醇洗脱柱子（速度控制在1mL/min左右）。将洗脱液于低于40℃下氮气吹干，用1.0mL甲醇：水（1:1，v/v，水含0.1%甲酸）复溶，0.22μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定。
7.3 标准曲线绘制
在仪器的最佳条件下，经过代化的前处理方法提取得到空白粪样溶液。分别用甲醇：水=1：1溶液稀释标准混合工作液，配制0、5、10、50、100、200、500、1000μg/L系列标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。分别以目标抗生素定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
7.4 测定
7.4.1 液相色谱参考条件
7.4.1.1 色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒度...