本标准按GB/T1.1-2009的规则编制，由湖南省畜牧水产局提出并归口。起草单位包括湖南省畜禽水产品质量检验检测中心、湖南省兽药饲料监察所。主要起草人有谭美英、易建希、陈福华、邓云波、肖安东、隆雪明、周玉洁、匡光伟、徐丽枚、宋跃君、邓防、何红艳。 1 范围 本标准规定了饲料中硝呋烯的测定方法，采用高效液相色谱法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂混合饲料中硝呋烯的残留量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1-2005 饲料采样 3 原理 采用二甲亚砜-乙睛溶液提取试样中的硝呋烯残留，使用混合型阳离子固相萃取柱进行净化，氨化二甲亚砜-乙睛溶液洗脱，最后通过高效液相色谱（紫外检测器）进行测定，采用外标法进行定量分析。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。 4.1 氮水 4.2 二甲亚砜（色谱纯） 4.3 乙睛（色谱纯） 4.4 缓冲溶液：将3.034g庚烷酸钠和3.152g柠檬酸溶解并定容至1L，用三乙胺调节pH至2.5 4.5 流动相：缓冲溶液-乙腈=55+45 4.6 提取液（二甲亚砜-乙睛溶液）：将40ml二甲亚砜与60mL乙睛混合均匀 4.7 洗脱液（4%氮水-二甲亚-乙腈溶液）：将4mL氮水与96mL二甲亚砜-乙睛溶液混合均匀 4.8 硝呋烯对照品：含硝呋烯残留应大于98% 4.9 标准储备液配制：将硝呋烯对照品0.01g置于10mL容量瓶中，加适量二甲亚砜溶解，用乙腈定容至1.0g/mL 4.10 标准工作溶液配制：根据标准储备液配制不同浓度的标准工作液 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器 5.2 分析天平：感量0.00001g和0.001g 5.3 固相萃取装置 5.4 旋涡混匀器 5.5 离心机 5.6 超声波清洗机 6 采样 采样步骤应按GB/T14699.1-2005执行。 6.1 试样制备：将采集的饲料样品用四分法缩减至200g，粉碎通过0.45mm筛网，混匀后装入磨口瓶备用。 7 测定步骤 7.1 样品提取：称取5g试样（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加入25.0mL提取液，涡旋混合，超声提取10min，6000r/min离心10min，取上清液并合并两次提取液。 7.2 净化：将SPE柱用乙睛和二甲亚砜-乙腈溶液活化，过柱并洗脱，收集洗脱液，经过0.45μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。 7.3 HPLC测定 7.3.1 高效液相色谱条件：色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速：1mL/min，进样量：20μL，检测波长：382nm 7.3.2 HPLC测定：根据标准溶液和样品溶液的色谱保留时间定性，采用外标法定量。