DB44/T1991-2017
灵芝及其相关产品中麦角留醇的测定 高效液相色谱法
Determination of ergosterol in Ganoderma lucidum and related products - HPLC method

前言
本标准编制依据GB/T 1.1-2009的规则起草。本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由广东粤微食用菌技术有限公司提出。本标准由广东省质量技术监督局归口。
本标准起草单位：广东粤微食用菌技术有限公司、广东省微生物研究所。
本标准起草人：谢意珍、焦春伟、张一帆、罗翠婷、李向敏、李洁仪、简伟明、李崇、杨小兵、吴清平。
本标准为首次发布。

1 范围
本标准规定了用高效液相色谱法测定灵芝及其相关产品中麦角留醇的方法。本标准适用于灵芝（赤芝）子实体、菌丝体（干品），及其制品孢子粉（破壁孢子粉）和灵芝孢子油中麦角留醇的测定。
本标准检出限为1 $mu$g/L。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。凡是注日期的引用文件，其注日期的版本适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 9008
GB/T 1272

3 术语和定义
3.1 麦角留醇 ergosterol, CAS号 57-87-4, 分子量 396.65, 结构式见附录A。主要存在于真菌中，对维持菌细胞膜完整性和流动性起重要作用，也是测量真菌生物量的指标。

4 方法提要
试样经95%乙醇提取、离心后，取清液经0.45 $mu$m 过滤膜过滤，经高效液相色谱柱分离，依据保留时间定性，用外标法面积定量。

5 试剂和材料
除非另有规定，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682中规定的三级水要求，色谱用水符合GB/T 6682中规定的一级水要求。
5.1 甲醇：色谱纯。
5.2 95%乙醇。
5.3 麦角留醇对照品（CAS：57-87-4）：纯度≥95%。
5.4 98%甲醇：用甲醇（5.1）980mL，定容至1000mL，混匀，过0.45 $mu$m 滤膜（5.7）。
5.5 麦角留醇标准储备溶液：精确称取10.0mg麦角留醇标准物质（5.3），用甲醇（5.1）溶解并定容至50mL。使用前配制。
5.6 麦角留醇标准工作溶液：吸取麦角留醇标准储备液（5.5）并分别以甲醇（5.1）稀释成麦角留醇浓度为20 $mu$g/mL、40 $mu$g/mL、80 $mu$g/mL、160 $mu$g/mL、320 $mu$g/mL、640 $mu$g/mL的系列标准工作溶液。使用前配制。
5.7 滤膜（有机相）：0.45 $mu$m。

6 仪器和设备
6.1 高效液相色谱仪（带紫外检测器）。
6.2 万分之一天平（精度为0.0001g）。
6.3 水浴锅。
6.4 样品粉碎机。
6.5 离心机。
6.6 旋转蒸发仪。
6.7 循环水式真空泵。

7 测定方法
7.1 试样处理
7.1.1 灵芝子实体：取经过60℃烘干的灵芝子实体（含菌盖和菌柄）进行粉碎（子实体粉碎后呈棉絮状，但不能有明显块状），取粉碎后样品1.00g，加入95%乙醇（5.2）50mL，85℃恒温水浴回流1h，过滤，滤液暂存。残渣再按上述方法提取2次，合并滤液，离心（8800g, 10min, 不超过25℃）去除不溶物，减压浓缩至小于10mL（不超过60℃），用甲醇（5.1）定容至10mL，过滤（5.7），取滤液供色谱测定。使用前提取。过滤膜的滤液要在24h内完成测定。
7.1.2 灵芝菌丝体：取经过50℃烘干的灵芝菌丝体进行粉碎，取粉碎后样品（过40目筛）0.50g，加入95%乙醇（5.2）50mL，85℃恒温水浴回流1h，过滤，滤液暂存。残渣再按上述方法提取2次，合并滤液，离心（8302g, 10min, 不超过25℃）去除不溶物，减压浓缩至小于10mL（不超过60℃），用甲醇（5.1）定容至10mL，过滤（5.7），取滤液供色谱测定。使用前提取。过滤膜的滤液要在24h内完成测定。
7.1.3 破壁灵芝孢子粉：取破壁灵芝孢子粉1.00g，加入96%乙醇（5.2）50mL...