DB51/T1284-2011 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范 前言 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口，由四川省质量技术监督局批准，四川省动物疫病预防控制中心负责起草。起草人包括张焕容、余勇、张东、毛光琼、汤承、岳华、陈代平、郭莉、吴宣、李金海、罗毅。本标准附录A为资料性附录。 1 范围 本标准规定了空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的分离与鉴定方法，适用于鸡、鸭、鹅、野禽、猪、牛等多种育禽的空肠弯曲杆菌分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注明日期的引用文件，其指定版本适用本标准；未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用本标准。 - GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）可致多种动物和人腹泻，在环境及健康动物体内广泛存在。菌体大小为0.3~0.4 μm × 1.5~3.0 μm，弯曲杆状或海鸥展翅状，暴露于空气中后很快形成球状体，革兰氏染色阴性。 3.2 聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定DNA片段。 3.3 引物（Primer）是人工合成的两段寡核酸序列，用于PCR反应，其中一条引物与目标片段一端的DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端互补。 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 4.1 设备和材料 - 二氧化碳培养箱 - 微量移液器及相应型号无菌吸头（0.1~10 μL, 2~20 μL, 20~200 μL, 200~1000 μL） - 微型离心机（适合PCR反应管操作） - 无菌工作台 - 接种环、接种针、酒精灯及酒精棉球 - PCR扩增仪及电泳仪 4.2 培养基和试剂（见附录A） - 改良Skirrow氏琼脂基础培养基 - 空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基 - Cary-Blair氏运送培养基 - 革兰氏染色液、TAE缓冲液、琼脂糖及显色液 - 生化试剂：3%过氧化氢、1%盐酸二甲基对苯二胺、1%α-茶酚～乙醇溶液、甘氨酸、醋酸铅培养基、马尿酸钠培养基、三氯化铁、茶啶酸、硝酸盐培养基、对氨基苯磺酸、醋酸、奈胺、TTC琼脂基础培养基 - PCR鉴定试剂：Taq DNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（2.5 mmol/L）、10×PCR缓冲液（无Mg） 4.2.9 分离培养方法 - 用灭菌棉签无菌采集动物的泄殖腔、空肠、盲肠内容物 - 将采样棉签放入运送培养基，带回实验室划线或直接划线于Skirrow氏培养基平板 - 平板置于42℃、10%二氧化碳培养箱培养48 h - 挑取疑似空肠弯曲杆菌的单个菌落（直径1~2 mm，透明，表面光滑），进行革兰氏染色镜检 - 将符合特征的菌落接种于空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基平板，置于42℃、10%二氧化碳培养箱中纯化培养24~48 h - 如含有杂菌，需重复纯化直至革兰氏染色镜检为弯曲杆菌 4.3 细菌鉴定 4.3.1 细菌染色鉴定：革兰氏染色阴性 4.3.2 生化鉴定（“+”为阳性反应，“-”为阴性反应）：触酶试验（+）、氧化酶试验（+）、甘氨酸试验（+）、硫化氢试验（-）、马尿酸钠试验（+）、萘啶酸抑制试验（+）、硝酸盐还原试验（-）、TTC试验（+） 4.3.3 PCR鉴定