β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术

ICS 67.050
CCS X 04
DB37
山东省地方标准
DB37/T 4415—2021
发布日期：2021-10-18
实施日期：2021-11-18
发布单位：山东省市场监督管理局

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。
本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。
本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉、高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。

1 范围

本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
GB/T 27642—2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法
NY/T 1663—2008 乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
NY/T 1672—2008 绵羊多胎主效基因Fec分子检测技术规程
NY/T 2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程
SN/T 2497.16—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第16部分：Western-Blot实验
农业部2031号公告-14-2013 转基因动物及其产品成分检测 普通牛（Bos taurus）内标准基因定性PCR方法

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 Bos taurus β-lactoglobulin BLG 牛β-乳球蛋白基因

BLG基因（NCBI Reference sequence: NC_037338.1），简称PAEP，来源于普通牛（Bos taurus），编码β-乳球蛋白的基因。
注：基因全长4900bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸。

3.2 β-乳球蛋白基因敲除奶牛 β-lactoglobulin knockout cow

利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。

4 聚合酶链式反应（PCR）法—基因定性检测

4.1 原理

通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。

4.2 试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.2.1 水：GB/T 6682，三级。

4.2.2 50×TAE缓冲液：称取Tris-base 242.2g，加入冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）100mL，用水定容至1000mL。使用时，用水稀释为1×TAE。

4.2.3 1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。

4.2.4 BLG基因引物：
上游引物：5'-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3'
下游引物：5'-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3'
预测野生型扩增片段大小为6728bp。

4.2.5 内标准基因引物：参照农业部2031号公告-14-2013。

4.2.6 引物溶液：引物用水稀释到10μmol/L。

4.3 仪器设备

4.3.1 PCR扩增仪：温度范围4℃~99℃，温度梯度范围20℃，模块单元96×0.2mL。
4.3.2 离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2mL。
4.3.3 电子天平：量程0.001g~100g，感量0.001g。
4.3.4 凝胶成像分析系统。
4.3.5 稳压稳流电泳仪：输出电压0V~600V，输出电流0mA~100mA。
4.3.6 高压灭菌锅：使用温度范围45℃~135℃，最高使用压力0.255MPa。
4.3.7 微波炉。

4.4 样品

4.4.1 采集静脉血样3mL~5mL，医用抗凝管或ACD抗凝，-20℃以下保存。
4.4.2 采集组织（耳组织等）0.1g~0.3g，浸入75%的酒精，-20℃以下保存。
4.4.3 采集带毛囊的牛毛20~30根，浸入75%的酒精或置于毛囊卡，-20℃以下保存。
4.4.4 采集0.2mL~0.5mL鲜精或1~2支细管冷冻精液，备用。

4.5 试验步骤

4.5.1 DNA提取
基因组DNA提取按照GB/T 27642—2011附录B规定执行。

4.5.2 DNA浓度和纯度检测
DNA浓度和纯度检测按照NY/T 1672—2008中7.3的规定执行。

4.5.3 PCR扩增

4.5.3.1 样品PCR扩增

4.5.3.1.1 内标准基因PCR扩增
反应体系及反应程序按照农业部2031号公告-14-2013。

4.5.3.1.2 基因特异性序列PCR扩增

4.5.3.1.2.1 PCR扩增体系
Taq DNA聚合酶 0.5μL；
2×PCR buffer 25μL；
dNTP Mixture (2.5mM) 8μL；
上下游引物 (10μM) 各1.0μL；
模板DNA 200ng~1μg；
加双蒸水至总体积50μL。

4.5.3.1.2.2 PCR扩增程序
94℃ 1min；
94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 6min，35个循环；
72℃ 10min，4℃保存。

4.5.3.2 对照PCR扩增
以野生型奶牛基因组DNA（序列信息见附录A）作为阴性对照；以含有16bp缺失的BLG基因敲除奶牛基因组DNA（序列信息见附录B）作为阳性对照；以水作为空白对照。除DNA模板外，对照PCR扩增条件与4.5.3.1.2相同。

4.5.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
按照NY/T 2695—2015中6.4.2的规定执行。

4.5.5 测序分析
将检测合格的PCR产物进行全长测序分析。

4.6 结果判定与表述

4.6.1 对照检测结果分析
在内标基因、阳性对照和阴性对照PCR扩增中，内标基因和BLG基因特异性序列均扩增出与预期大小一致的产物，空白对照无预期扩增片段，则表明PCR反应体系正常；否则，需重新扩增。

4.6.2 样品检测结果判定和表述
PCR扩增的β-乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录A。对测序结果和参考序列进行比对判定样品是否发生基因敲除。

4.6.2.1 如果样品序列与参考序列一致，未造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因未敲除奶牛”。
4.6.2.2 如果样品序列与参考序列比对，出现突变，且提前引入了终止密码子，造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因敲除奶牛”。

5 免疫印迹（Western-Blot）法—蛋白定性检测

5.1 原理

对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有β-乳球蛋白。

5.2 试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

5.2.1 水：GB/T 6682，三级。
5.2.2 牛β-乳球蛋白标准品储液（10mg/mL）：称取0.1g牛β-乳球蛋白，溶解于10mL双蒸水中，分装，-20℃以下保存。
5.2.3 10% SDS：将10g的SDS粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。
5.2.4 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。