ICS67.050 ccs x04 DB37 方标准 山东省地 DB37/T4415-—2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术 Detection ofβ-lactoglobulin geneknockout cow and β-lactoglobulin in cow's milk2021-10-18发布 山东省市场监督管理局 发布 2021-11-18实施 前言 DB37/T4415-2021 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。I DB37/T4415-2021 β一乳球蛋白基因敲除奶生的鉴定及牛奶中β一乳球蛋白的检测技术1范围 本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛奶中βB-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1663一2008乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法NY/T1672—2008绵羊多胎主效基因Fec分子检测技术规程NY/T2695一2015牛遗传缺陷基因检测技术规程SN/T2497.16—2010进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验 农业部2031号公告-14-2013转基因动物及其产品成分检测普通牛（Bostaurus）内标准基因定性PCR方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 Bostaurusβ-lactoglobulinBLG牛β-乳球蛋白基因 BLG基因（NCBIReferencesequence：NC_037338.1），简称PAEP，来源于普通牛（Bostaurus），编码β-乳球蛋白的基因。 注：基因全长4900bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸3.2 β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。4聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性检测4.1原理 通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。1 4.2试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T6682，三级。 DB37/T4415—2021 4.2.250×TAE缓冲液：称取Tris-base242.2g，加入冰乙酸57.1mL,0.5mo1/LEDTA（pH8.0)100mL，用水定容至1000mL。使用时，用水稀释为1×TAE。4.2.31%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。4.2.4BLG基因引物： 一上游引物：5'-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3*；下游引物：5-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3预测野生型扩增片段大小为6728bp。4.2.5内标准基因引物：参照农业部2031号公告-14-2013。4.2.6 引物溶液：引物用水稀释到10μmo1/L。4.3 仪器设备 4.3.1 PCR扩增仪：温度范围4℃~99℃，温度梯度范围20℃，模块单元96×0.2mL。2离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2ml。4.3.2 4.3.3电子天平：量程0.001g~100g，感量0.001g。4.3.4凝胶成像分析系统， 4.3.5 5稳压稳流电泳仪：输出电压0V~600V，输出电流0mA~100mA。4.3.6 高压灭菌锅：使用温度范围45℃135℃，最高使用压力0.255Mpa。4.3.7 微波炉。 4.4样品 采集静脉血样3mL～5mL，医用抗凝管或ACD抗凝，-20℃以下保存。4.4.1 2采集组织（耳组织等）0.1g～0.3g，浸入75%的酒精，-20℃以下保存。4.4.2 4.4.3采集带毛囊的牛毛20～30根，浸入75%的酒精或置于毛囊卡，-20℃以下保存。4.4.4采集0.2mL~0.5mL鲜精或1~2支细管冷冻精液，备用。4.5试验步骤 4.5.1 DNA提取 基因组DNA提取按照GB/T27642—2011附录B规定执行。4.5.2DNA浓度和纯度检测 DNA浓度和纯度检测按照NY/T1672—2008中7.3的规定执行。4.5.3PCR扩增 4.5.3.1样品PCR扩增 内标准基因PCR扩增 4.5.3.1.1 反应体系及反应程序按照农业部2031号公告-14-2013。4.5.3.1.2基因特异性序列PCR扩增2 DB37/T4415-2021 4.5.3.1.2.1PCR扩增体系。TaqDNA聚合酶0.5μL；2×PCRbuffer25μL：dNTPMixture(2.5mM）8μL；上下游引物（10μM）各1.0μL：模板DNA200ng~1μg：加双蒸水至总体积50μL。4.5.3.1.2.2PCR扩增程序。94℃1min；94℃30s，52℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min4℃保存。 4.5.3.2对照PCR扩增 以野生型奶牛基因组DNA（序列信息见附录A）作为阴性对照：以含有16bp缺失的BLG基因敲除奶牛基因组DNA（序列信息见附录B）作为阳性对照；以水作为空白对照。除DNA模板外，对照PCR扩增条件与4.5.3.1.2相同。4.5.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测按照NY/T2695—2015中6.4.2的规定执行。4.5.5测序分析 将检测合格的PCR产物进行全长测序分析。4.6结果判定与表述 4.6.1对照检测结果分析 在内标基因、阳性对照和阴性对照PCR扩增中，内标基因和BLG基因特异性序列均扩增出与预期大小一致的产物，空白对照无预期扩增片段，则表明PCR反应体系正常：否则，需重新扩增4.6.2样品检测结果判定和表述 PCR扩增的β-乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录A。对测序结果和参考序列进行比对判定样品是否发生基因敲除。 4.6.2.1如果样品序列与参考序列一致，未造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因未敲除奶牛”。4.6.2.2如果样品序列与参考序列比对，出现突变，且提前引入了终止密码子，造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因敲除奶牛”。 免疫印迹（Western-Blot）法-蛋白定性检测5 5.1原理 对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有β一乳球蛋白。5.2试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水：GB/T6682，三级。 5.2.2牛β-乳球蛋白标准品储液（10mg/mL）：称取0.1g牛β-乳球蛋白，溶解于10mL双蒸水中，分装，-20℃以下保存。 5.2.310%SDS：将10g的SDS粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。5.2.430%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N2-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。 3