DB65/T4371—2021
马泰勒虫病荧光定量PCR诊断技术规程
The regulation of PCR diagnostic method for equine piroplasmosis
2021-06-22发布
2021-09-01实施
新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布

前言
DB65/T4371—2021
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由新疆农业大学提出。
本文件由新疆维吾尔自治区畜牧业标准化委员会归口并组织实施。
本文件起草单位：新疆农业大学、新疆畜牧科学院、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。
本文件主要草案人：张伟、孔冰洁、刘丹灯、巴帝查汗·益力克、宋瑞其、张杨、孟元、郭庆勇、米晓云、艾力登才次克、李斌、李永畅、张梦圆、范士龙、韦丽婷。
本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆农业大学、新疆畜牧科学院、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。
对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167号）、新疆维吾尔自治区畜牧业标准化委员会（乌鲁木齐市新华南路408号）、新疆农业大学（乌鲁木齐市农大东路33号）。
联系方式：
新疆维吾尔自治区市场监督管理局：电话 0991-2817197；
新疆维吾尔自治区畜牧业标准化委员会：电话 0991-8568308；
新疆农业大学：电话 0991-8763453；
新疆畜牧科学院：电话 0991-3098109；
新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心：电话 0991-4873795。

1 范围
马泰勒虫病荧光定量PCR诊断技术规程本文件规定了马泰勒虫病荧光定量PCR诊断方法，本文件适用于动物诊疗机构及动物疫病防控机构对马泰勒虫病的检测。

2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 马泰勒虫病 equine piroplasmosis
由泰勒虫属的马泰勒虫（Theileria equi）寄生于马属动物红细胞、淋巴细胞而引起的一类原虫性血液原虫病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类疫病，我国将其列为二类疫病。本病的主要临床特征为稽留热、贫血、黄疸和血虫症，其病死率尚高。
3.2 马泰勒虫 Theileria equi
隶属于原生动物门（Protozoa）、复顶亚门（Apicomplexa）、梨形虫纲（Piroplasmida）、泰勒科（Theileriidae）、泰勒属（Theileria）。马泰勒虫生活史参见附录A。
3.3 荧光定量PCR real-time PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR反应过程。
3.4 Ct值 cycle threshold

4 缩略语
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein）
TAMRA：四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）
dNTPs：脱氧核糖核苷酸三磷酸（deoxynucleotide triphosphates）
Taq：Taq DNA聚合酶
DNA：脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleic acid）
DEPC：二乙基焦磷酸盐（diethyl pyrocarbonate）

5 诊断方法
5.1 主要设备、耗材和试剂
-4°C冰箱、-20°C冰箱、高速离心机、Real-time PCR仪、核酸电泳分析仪、高压灭菌器、电子天平、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（10μL, 100μL, 1000μL）、无菌采血管、无菌采血针、1.5 mL EP管、枪头（10μL, 100μL, 1000μL）、PCR反应管、核酸提取试剂、PCR反应试剂。

5.2 样品采集、保存
采集新鲜马属动物无菌抗凝血约10 mL，及时进行核酸提取，提取的核酸可放入-20°C冰箱保存待检。若采集的血液暂时无法进行核酸提取，可暂时放入-20°C冰箱短暂保存。

5.3 检测方法
5.3.1 引物合成
上游引物 F1：5'-TTGCGGTGTTTCGGTGA-3'
下游引物 R1：5'-ATAGGTCAGAAACTTGAATGATACA-3'
特异性探针：5'-FAM-ATAAATTAGCGAATCGCATGGCTT-TAMRA-3'

5.3.2 PCR扩增体系
见表1。
表1 荧光定量PCR扩增反应体系
组分 | 储备液浓度 | 加样量/μL (25μL体系)
---|---|---
10×PCR buffer (不含Mg) | - | 2.5
MgCl2 | - | 1.0
dNTPs | 2.5 mmol/L | 2.0
Taq DNA聚合酶 | 10 U/μL | 0.35
上游引物 F1 | 10 μM | 1.0
下游引物 R1 | 10 μM | 1.0
特异性探针 | - | 0.5
DEPC水 | - | 16.65 (注：根据总量25μL估算)

PCR反应参数：94℃预变性2min；（94℃变性15s，56℃退火50s，共40个循环）

5.3.3 质量控制
每个样品设置两个平行的反应体系，检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。使用马泰勒虫阳性血液样品作为阳性对照，用已知不含马泰勒虫血液样品作为阴性对照，用等体积双蒸水代替模板DNA作为空白对照。
以下条件中有一条不满足时，实验视为无效：
a) 空白对照：无荧光信号增长，相应的Ct值 > 40；
b) 阴性对照：无荧光信号增长，相应的Ct值 > 40；
c) 阳性对照：有荧光信号增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值 < 30。

5.3.4 结果判定
在符合5.3.3规定的情况下，被检样品进行检测时：
a) 如Ct值 ≤ 35，则判定为被检样品阳性；
b) 如Ct值 ≥ 40，则判定为被检样品阴性；
c) 如 35 < Ct值 < 40，则重复一次，如再次扩增后Ct值仍为 < 40，则判定为被检样品阳性；如再次扩增后Ct值 ≥ 40，则判定为被检样品阴性。

5.3.5 结果表述
具体要求如下：
a) 结果为阳性者，表述为“马泰勒虫病阳性”；
b) 结果为阴性者，表述为“马泰勒虫病阴性”。

6 检出限
本方法规定的最低检出限为1×10¹拷贝/μL。