DB11/T819-2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 前言 本标准按照B/T1.1—2009的规则起草，由北京市农业局提出，由北京市农业标准化技术委员会归口组织实施，起草单位为北京市水产技术推广站。主要起草人包括王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。 1 范围 本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（KHMD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、PCR检测方法和结果判定标准，适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 - GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 - SGT7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 缩略语 - KHV：锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus） - KHMD：锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease） - PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） - DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） - Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） - dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） 4 样品要求 4.1 水温：采集样品时水温应在16℃～32℃。 4.2 品种：采样品种为锦鲤或鲤。 4.3 数量：按SGT7103规范执行。 4.4 状态：采集的样品不得腐败。 4.5 信息采集：需记录发病情况、混养鱼类发病情况、水温等信息。 5 锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特征 5.1 临床症状：患KHMD的锦鲤和鲤主要表现为烂鳃、鳃出血并产生黏液、鳃丝溃烂、体表苍白块斑和水泡、鳍条及尾鳍充血、鳞片上出现血丝、眼球凹陷、口腔和腹部充血及出血。 5.2 流行病学特征：混养池塘中仅锦鲤或鲤发病死亡，其它鱼种不受影响；水温18℃～30℃，尤其25℃～28℃时死亡率高；从出现临床症状到死亡通常24～48小时；疾病发生后10天内死亡率可达80%～100%。 6 PCR检测方法 6.1 试剂和材料 6.1.1 水：符合GB/T6682-2008中一级水规格。 6.1.2 KHV阳性核酸片段：由农业部指定机构提供。 6.1.3 Taq酶：20℃保存，避免反复冻融和剧烈温度变化。 6.1.4 dNTP：10 mmol/L。 6.1.5 氯化镁溶液浓度：25 mmol/L。 6.1.6 TK基因引物（409 bp）：KHV-TK-F: 5'-CCGTTACCT-GTACGAG-3'; KHV-TK-R: 5'-CACAGTAGAT-TAT-CC-3' 6.1.7 Sph基因引物（292 bp）：KHV-Sph-F: 5'-GACACCACATCT-GCAAGGAG-3'; KHV-Sph-R: 5'-GACACATGTTACAAT-GCT-CGC-3' 6.1.8 DEPC水：用焦碳酸二乙酯处理。 6.2 器材和设备 6.2.1 普通冰箱和超低温冰箱 6.2.2 组织研磨器