ICS 65.020.30 B41 DB41 河南省地方标准 DB41/T 1516—2017 犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法 2017-12-06 发布 河南省质量技术监督局 发布 2018-03-06 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出。 本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心、驻马店市动物疫病预防控制中心、三门峡市动物疫病预防控制中心、鹤壁市畜产品质量监测检验中心、信阳市动物疫病预防控制中心、平顶山市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：闫若潜、班付国、王华俊、赵雪丽、谢彩华、刘梅芬、赵明军。 本标准参加起草人：杨晴、孙素芳、曹伟伟、王淑娟、郭育培、王建科、黄清、韩楠、马超锋、朱前磊、杨海波、李方方。 1 范围 本标准规定了犬瘟热病毒（CDV）和犬细小病毒（CPV）二重TaqMan MGB实时荧光PCR（FQ-PCR）检测方法，包括样品采集、处理、保存及运输、操作方法及结果判定。 本标准适用于疑似CDV、CPV感染动物的唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物、血清等样品，以及死亡动物的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品的病毒核酸检测。 2 试剂和仪器设备 2.1 试剂 2.1.1 拭子悬液、组织悬液（见附录A），-20℃保存。 2.1.2 裂解液（Trizol）、氯仿、1×核酸电泳缓冲液、0.01 mol/L（pH7.2）磷酸盐缓冲液（PBS）、DEPC处理水，4℃保存。 2.1.3 异丙醇、75%乙醇，-20℃保存。 2.1.4 消化液I、TE缓冲液常温保存；消化液II、阳性对照、阴性对照，-20℃保存。 2.1.5 酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），4℃保存。 2.1.6 TaqMan FQ-PCR检测用引物及探针序列见附录B。 2.1.7 二重TaqMan FQ-PCR反应体系见附录C。 2.2 仪器设备 实时荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机（12000×g以上）、生物安全柜、恒温水浴锅、2℃～8℃冰箱、-70℃冰箱、微量移液器（0.1μL～1000μL）、组织匀浆器或研钵等。 3 样品采集、处理、存放及运输 3.1 样品采集及处理 3.1.1 疑似感染动物样品 采集唾液、鼻液、眼分泌物、粪便及肠内容物等样品，加入拭子悬液后混匀，4℃、5000 r/min离心10 min，取上清备用。 3.1.2 组织样品 采集淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等病变组织约0.5 g，充分匀浆后加入组织悬液混匀，4℃、5000 r/min离心10 min，取上清备用。 3.1.3 血清样品 无菌采血3 mL～5 mL，分离血清后直接转入无菌Eppendorf管备用。 3.2 存放与运输 样品密封后冷藏运输（2℃～8℃），保存时间不超过24 h；超过24 h需-20℃以下保存，避免反复冻融。 4 操作方法 4.1 样品RNA的制备 4.1.1 在1.5 mL离心管中加入裂解液300 μL，再加入待检样品、阴性对照、阳性对照各100 μL，充分混匀后加入氯仿100 μL，颠倒混匀后4℃、12000 r/min离心15 min。 4.1.2 取上清150 μL转入新管，加入等体积预冷异丙醇，室温静置15 min。 4.1.3 4℃、12000 r/min离心15 min后弃上清，进行后续RNA提取步骤。