DB37/T2312-2013 转hLTF基因奶牛的PCR鉴定技术规程 发布：2013-04-01 实施：2013-05-01 发布单位：山东省质量技术监督局 前言 本标准按照GB/T1.1-2009起草，由山东省畜牧兽医局提出，并由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位包括山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。主要起草人有黄金明、侯明海、翰志花、张思聪、冯敏燕、李秋玲、王长法、齐超、张燕、李建斌、何洪彬、戴蕴平、仲峰。 1 范围 本标准规定了转hLTF基因奶牛的分子鉴定技术方法，适用于转hLTF基因奶牛中转基因成分的分子检测。 2 规范性引用文件 以下文件对于本标准的应用是必不可少的： - GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法 - NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求 - NY/T1672 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 - SN/T1917 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 - NYB953-5 转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法 - DB37/T2037 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程 3 术语和定义 3.1 hLTF基因：人乳铁蛋白基因。 3.2 转hLTF基因奶牛：利用转基因技术将人乳铁蛋白基因导入奶牛细胞或胚胎，通过克隆技术培育而成的奶牛。 4 鉴定原理 针对转hLTF基因奶牛的hLTF基因，根据外源人LTF基因与内源牛LTF基因的同源性，在编码区设计特异性引物进行PCR扩增，用凝胶电泳检测产物，有无产物来判定试样是否含有转hLTF基因成分，从而判定奶牛为转基因阳性或阴性。 5 主要试剂配制 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682的双蒸水；试剂配制应按照DB37/T2037规定执行，实验室应符合NY/T672的规定。 6 主要仪器设备 按照DB37/T2037中的规定执行。 7 检测方法 7.1 样本采集 静脉采集血样3~5 mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。亦可采集耳组织0.01~0.05 g，液氮保存。 7.2 试样DNA提取 7.2.1 血液DNA提取 用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA，处理按照SN/T1917执行。也可用商业化DNA提取试剂盒。 7.2.2 组织DNA提取 组织样品DNA提取方法参照NYB953-5执行，或使用商业化DNA提取试剂盒。 7.3 DNA浓度和纯度检测 按照NY/T1672规定执行。 7.4 引物序列 用于扩增hLTF基因的特异引物序列： hLTF1：5'-CTGGGACTAGAGGTGCTTGAC-3' hLTF2：5'-GGCAGATGGTAGGAGGTAGGA-3' 扩增片段大小为921 bp。 7.5 对照DNA样品制备 阳性对照DNA：利用hLTF1和hLTF2引物，以人基因组DNA或互补DNA为模板，采用常规PCR扩增hLTF片段，纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌后提取质粒（pMD18-hLTF），并进行测序验证。 阴性对照DNA：从非转hLTF基因牛的血液或组织中提取DNA。 7.6 PCR扩增 7.6.1 PCR扩增体系 模板DNA 50 ng，10×Buffer 2.5，MgCl2 1.2 mmol/L，dNTP 0.6 μL，Taq DNA聚合酶 2 U，上下游引物各 1.0 μL，双蒸水补足至总体积 25 μL。 7.6.2 PCR扩增反应设计 PCR扩增包括待测样品管、空白对照管（双蒸水模板）、阳性对照管（质粒pMD18-hLTF）。