ICS 11.220 B41 辽宁省地方标准 DB21/T2323-2014 亚洲I型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法 Method of RT-PCR for the detection of type Asia I foot and mouth disease virus 2014-07-05发布 辽宁省质量技术监督局 2014-09-05实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：杨本勇、曹东、李井春、王宏燕、李树博、段亚良、刘坤洋、何利昆、王军、丁静、张鑫、王芬、王海波。 1 范围 本标准规定了亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV-Asia I）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于动物及动物产品中亚洲I型口蹄疫病毒的检测。 2 规范性引用文件 分析实验室用水规格和试验方法 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 DEPC（diethylpyrocarbonate）：焦碳酸二乙酯 RNA（ribonucleic acid）：核糖核酸 RT-PCR（reverse transcription PCR）：反转录聚合酶链反应 dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate）：脱氧核苷酸三磷酸 bp（base pair）：碱基对 O-P液（oesophagus-pharyngeal）：牛、羊食道-咽部分泌物 EB（Ethidium bromide）：溴化乙锭 FMDV-Asia I（Foot-and-mouth disease virus serotype Asia I）：亚洲I型口蹄疫病毒 4 原理 FMDV是一种RNA病毒，其RNA经反转录生成cDNA后可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-Asia I保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶作用下，以cDNA为模板，通过变性、退火和延伸循环扩增，获得特异性DNA产物。 5 实验材料、仪器设备和试剂 5.1 实验材料 眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、500mL三角瓶及吸头（10μL、200μL、1000μL）。 5.2 仪器设备 分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱及可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。 5.3 试剂 2.5 mmol/L dNTP 5.3.1 引物：上游引物5'-GCGCTCGTCCACACAGGACCGG-3'，下游引物5'-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3' 5.3.3 10×PCR缓冲液 5.3.4 1%溴化乙锭（EB）溶液 5.3.5 电泳缓冲液（50×） 5.3.6 1%琼脂糖凝胶 5.3.7 75%乙醇 5.3.8 灭菌DEPC水 5.3.9 上样缓冲液 5.3.10 电泳缓冲液（1×） 5.3.11 磷酸盐缓冲液（0.04 mol/L，pH 7.4） 5.3.12 其他试剂：AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、异丙醇、氯化镁溶液等 6 操作步骤 6.1 样品的采集、保存、运送和处理 6.1.1 样品采集 6.1.1.1 水泡液：未破裂水泡液用灭菌注射器抽取，加入抗生素后密封编号。 6.1.1.2 水泡皮：剪取新鲜水泡皮3～5g，加入甘油磷酸盐缓冲液后密封编号。 6.1.1.3 组织样品：无菌采集淋巴结、脊髓等组织样品3～5g，装入灭菌容器编号保存。