ICS 11.220 B41 辽宁省地方标准 DB21/T2327-2014 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法 Method of real time fluorescent PCR for the detection of porcine circovirus type 2 2014-07-05发布 辽宁省质量技术监督局 2014-09-05实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武、顾贵波、赵晓彤、崔基贤、陈瑶、魏澍、马建山、王竹、申贯男、赵风菊、李璐、李晓楠、于丹、王海丰。 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于PCV2的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液、排泄物和细胞培养物中PCV2核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽医实验室生物安全技术管理规范。 3 缩略语 PCV2：猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2）。 HSTaq酶：热启动Taq DNA聚合酶（HSTaq DNA polymerase）。 Ct值：达到阈值的循环数（cycle threshold）。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。 实时荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction）。 PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）。 4 原理 根据PCV2基因特定序列的保守片段，设计一对特异性引物和一条特异性探针。荧光探针5端标记FAM荧光素，3端标记TAMRA荧光素。正常情况下3端淬灭基团吸收5端报告荧光基团信号。在扩增过程中，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针切断，使报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。通过检测荧光信号实现核酸检测。 5 仪器和器材 5.1 仪器 主要仪器包括分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅及可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。 5.2 器材 组织研磨器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联管或96孔板、吸头及灭菌双蒸水、称量纸等。 6 试剂和材料 DNAzol Reagent：DNA提取试剂，4～8℃保存。 Premix Ex Taq（Probe qPCR）：用于TaqMan探针法实时PCR的预混液，-20℃保存，融化后4～8℃保存。 PBS（0.02mol/L，pH 7.2）。 无水乙醇：-20℃预冷。 75%乙醇：-20℃预冷。 阴性对照：灭菌双蒸水。 阳性对照：PCV2细胞培养物。 7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及前处理过程中应佩戴一次性手套，防止样本间交叉污染。 7.1.2 采样工具 药匙、15mL离心管和1.5mL离心管需121℃±2℃高压灭菌15min；剪刀、镊子需160℃干热灭菌2h。 7.1.3 内脏样品采集与前处理 采集病死或剖检猪的淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏，编号后送检。取约100mg样品，按1:5加入PBS研磨匀浆，1000g离心15min，取上清备用。 7.1.4 血液样品采集与处理 采集血液并加入含1/10 4%EDTA溶液的容器中混匀备用。 7.1.5 粪便样品采集与前处理 （原文后续内容缺失或未完整识别）