本标准自实施之日起代替GB/T 17376-1998。本标准等同采用ISO 5509：2000《动植物油脂 脂及酸甲酯制备》(英文版)。本标准是对GB/T 17376-1998《动植物油脂 脂及酸甲酯制备》的修订。本标准规定了脂肪酸甲脂的制备方法。本标准包括了从动植物油脂、脂肪酸及脂肪酸盐制备脂肪酸甲酯的方法。规定了以下三种甲酯化方法：ａ)三氟化硼法(见第3章)；ｂ)三甲基氢氧化硫法(见第4章)；ｃ)酯交换法(见第5章)。本标准适用于气相色谱、薄层色谱、红外光谱等需要甲酯衍生物的各种分析过程。本标准与GB/T 17376-1998的主要差异如下：——用异辛(色谱纯)代替庚烷试剂；——用三甲基氢氧化硫(TMSH)法代替原标准中的“不用三氟化硼的替代方法”；——用酯交换法代替原标准中的“四碳或四碳以上脂肪酸甲酯的特殊制备方法”；——将各方法中常用到的一些主要分析程序及原标准的第6章内容放在附录A中；——增加了资料性附录B。 GB/T 17376-2008 动植物油脂 脂肪酸甲酯制备 GB/T17376-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67. 200. 10
中华人民共和国国家标准
CB/T17376—2008/IS05509:2000代替GB/T 17376—1998
动植物油脂
脂肪酸甲酯制备
Animal and vegetable fats and oils-Preparation of methyl csters of fatty acids(ISO 5509:2000,IDT)
2008-11-04发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码脑低
中国国家标准化管理委员会
2009-01-20实施
GB/T 17376—2008/ISO 5509:2000本标准等同采用IS05509：2000《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》（英文版）。为便于使用，本标准对1S0）5509：2000进行了下列编擀性修改：删除国际标谁的前言；
“本国际标准”一词改为“本标准”；用小数点\”代替作为小数点的逗号“，”。本标准是对GB/T17376—1998《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》的修订。本标准与GB/T17376·1998的主要差异如下：-用异辛烷(色谱纯)代替庚烷试剂；用三中基氢氧化硫（TMSH)法代替原标准中的\不用三氟化硼的替代方法”-一用酯交换法代替原标准中的\叫碳或四碳以上脂肪酸中酯的特殊制备方法”将各方法中常用到的一些主要分析程序及原标准的第6章内容放在附录A中；增加了资料性附录B。
本标准白实施之日起代替GB/T17376…-1998。本标准中附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标推化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家粮食储备局西安油脂科学研究设计院。本标象与起草单位：陕西省产品质量监督检验所、安微大平工贸（集团）有限公司。本标准起草人：孟橘、夏大文、陈勇、王慧芳、朱文鑫、任春明。本标准所代督标准的历次版本发布情况为：-GB/T 1737G1998.
1范围
GB/T17376—2008/ISO5509:2000动植物油脂
首脂肪酸甲酯制备
小标准规定了脂肪酸甲脂的制备方法。本标准包括广从动植物油胎、脂肪酸及胎肪酸盐制备脂肪酸甲酯的方法。规定了以下三种甲酯化方法：
a）三氟化硼法（见第3章）：
b）三甲基氢氧化硫法（见第4章）；c）酯交换法（见第5章）。
本标准适用于气相色谱、薄层色谱、红外光谱等需要中酯衍生物的各种分析过程。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标推的条款。凡足注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/I66822008,ISO3696：2008，MOD）GB/T15687动植物油脂试样的制备(GB/T15687--2008,ISO661:2003,IDT)3三娠化硼法（常用方法）
警告：方法中涉及到危险试剂的使用，应采取适当的防护措施以保护眼睛，并避免离蚀性化学物品灼伤的危险，三氟化硼有毒，建议分析人员尽量不用甲醇和三氟化硼制取三氟化硼甲醇溶液（见附录A中第 A, 1章)。
3.1原理
甘油酯在氢氧化钠甲醇溶液中皂化，生成的脂肪酸盐与三氟化硼中醇溶液反应生成甲酯。如果要分析纯肪酸及其脂肪酸，则不需要皂化，直接与三氟化硼反应甲酯化。3.2适用范围
本方法适用于大多数油脂及衍生物（脂肪酸、脂肪酸盐），不适用于乳脂和含有下列基闭的化合物：一次氧基化合物(如：酮基、环氧基、羟基、氨过氧基）;——环内烷和环丙烷基化合物；-炔类脂肪酸。
如果油脂中仅含有少量的上述化合物（如棉籽油），仍可按第3章的般方法进行酷化。否则要采用第4章或第5章所述方法。
气相色谱分析中使用异辛烷做溶剂制得的甲酯溶液回收率最商，但对已酸甲酯的回收率只有75%。
3.3试剂
除有特殊说明，仅使用确认为分析纯的试剂。3.3.1水应符合GI3/T6G82中3级水的要求。3.3.2氢氧化钠甲醇溶液：约0.5mol/L。将2多氢氧化钠游于100mL含水不超过0.5%的甲醇中。该溶液存放时间较长时，可能会形成少量白色的碳酸钠沉淀，但不会影响甲酪的制备。1
GB/T17376—2008/IS05509:20003.3.3=氟化砸甲醇溶液：质量分数12%15%（见附录A的第A.1章）。3.3.4异辛烧（2,2，1-三甲基戊烷）：色谱纯（见附录A的第A.2章）。警告：异辛烷易燃易爆，在空气中的爆炸极限为1.1%～6.0%（体积分数）。异辛烷有毒，不要误食或吸入，操作应当在通风橱中进行。3.3.5氟化钠：钩和水溶液。
3.3.6无水硫酸钠。
3.3.7氮气:含氧最低于 5 mg/kg。3.3.8己烷：色谱纯，仪用于干酯制备，也可用石油醚：沸程40℃～60℃，溴值低于1，无残渣（见附录A的第A.2章）。
3.3.9甲基红；1g/L，溶于体积分数为60%的乙醇中。3.4仪器
实验室常用仪器，以及下列仪器：3.4.1磨口烧瓶：50rml或100mL，具塞。3.4.2[流冷凝器：有效长度200mm~300mm，具有与磨口烧瓶（3.4.1配合的磨口接头。3.4.3沸行：脱脂
3.4.4移液管或自动加液器：至少10mL。3.4.5玻璃瓶：具螺旋盖，容量至少4mL。3.4.6分液漏斗：250L用于干脂制备。3.4.7旋转蒸发仪。
3.4.8分析天平:分度值为0.001 g。3.5试样制备
试样应为液体且无水，透明，按照GB/T15687制备试样。如需加热样品，则采用刚好高了熔点的温度。
3.6操作步骤
普告：三氟化硼有毒，以下操作需在通风橱里进行，玻璃器具用后，应立即用水冲洗。3. 6. 1试样
根据所需样品试样量，按表1选择合适的烧瓶及适量的试剂和溶液。表1试样称取量
分析方法
（气液色谱）
IR/TLC
(红外光墙分析
薄层色谱）
3.6.2皂化
试样质量
100250
250~500
500--750
750--1 000
(3. 4. 1)/
氢氧化钢甲醇
三氟化硼甲醇
(3. 3. 3)/
3.6.2.1油脂从3.6.2.2开始进行脂肪酸及脂肪酸盐从3.6.2.3开始进行。溶剂
(3.3.4)或
(3. 3. 8)/
3.6.2.2将试样置于合适的烧瓶中（见表1和附录A），加入适量（见表1)氢氧化钠甲醇溶液（3.3.2）1）可选购 14%,20%、(Merck NO.8. 01663)和 50%的市售试剂,提供此信息仅是为了方便本标准的使用者,而不是对这些产品的认可。
及沸右（3.4.3），然后接上冷凝器（3.4.2），GB/T17376—2008/ISO5509.2000如果存在两个以上双键的脂肪酸，在回流前，迅速向烧瓶中导人几分钟下燥氮气（3.3.7)将空气排掉。
在水浴上流直全油滴消尖，每30～60s缓慢摇动烧瓶，以防止氢氧化钠形成固态附着在瓶壁上。回流过程通常需要5min~-10in：有些情况可能会更长（则附录A第A.3章和第A.4章）。用移液管从冷器顶部加人适量（见表1)的三氟化硼甲醇溶液（3.3.3）于沸腾的溶液里。接下来按照3.6.3或3.6.4步骤执行。3.6.2.3将试样置子合适的烧瓶中（见表1），加入适（见表1)的三氟化硼甲醇溶液（3.3.3），然后接冷凝器(3.4.2)。
接下来按照3.6.3或3.6.4步骤执行。3.6.3甲酯溶液制备（主要用于气液色谱分析）3.6.3.1继续煮沸3min。对丁含长链脂肪酸的油脂，如鱼油，继续煮沸30min。3.6.3.2从冷凝器顶部加人适量的异辛烷（3.3.4）于沸腾的混合液果。3.6.3.3取下冷凝器，拿出烧瓶，立即加人20mI.氯化钠溶液（3.3.5），塞住烧瓶，猛烈振摇至少15 s.
3.6.3.4继续加人氯化钠溶液（3.3.5)至烧瓶颈部，静置分层。3.6.3.5吸取1mL~2ml上层另辛烧溶液于玻璃瓶（3.4.5）中，加人适量无水硫酸钠（3.3.6)去除溶液中痕量的水，并按照以下几种方式注人气相色谱仪：a）直接注人填充柱（见附录A的第A5章）；b）先用异辛烷适度稀释再注人毛细管柱（见附录A的第A.6章）；c）对于毛细柱，特殊情况可使用沸点更低的庚烷释。3.6.4干甲酯制备（用于薄层色谱或红外光谱分析）3.6.4.1继续煮沸3min。
3.6.4.2从冷凝器顶部加入适量的已烷（3.3.8)于沸腾的混合溶液里。3.6.4.3取下冷凝器，拿山烧瓶。立即加人20ml.氯化钠溶液（3.3.5）。塞伴烧瓶，猛烈振摇至少15s.
3.6.4.4将混合溶液转移至250mL分液斗巾（3.4.6）。加入约30mL饱和氮化钠溶液，静置分层，保留已烷液。放出的化钠溶液再用50ml.己烷（3.3.8）萃取两次。3.6.4.5将已烷液和两次举取物合并，然后用每次20ml.蒸馏水（3.3.1)洗涤，直至用中基红试剂（3.3.9>检验不显酸性为止。再用无水硫酸钠（3.3.6）1燥、过滤，用水浴通氮气流（3.3.7)或使用旋转蒸发仪(3.4.7)蒸发溶剂。
在干酷制备过程中部分短链甲酯（Cs～C）会流失，不足500mg的试样，最好按比例减少氯化钠溶液、溶剂和蒸馏水体积,见附录 A 的第 A. 6 章。4三甲基氢氧化硫(TMSH)法
警告：方法中涉及到危险试剂的使用：应采取适当的防护措施以保护眼晴，并避免蚀性化学物品灼伤的危险。三甲基氢氧化硫甲醇溶液有毒。4.1原理
试样溶解于甲基叔丁醚中，通过与三甲基氢氧化硫甲醇溶液进行酯交换来实现中酯化。分析样品时气化宽温度高于250*C。如果样品中含有短链脂肪酸时（C4~C），推荐使用戊酸甲酯作为内标物（见4.2)。
：4.2适用范围
本快速中酯化方法仅适用于气相色谱分析用的甲酯制备。本方法适用于所有油脂，包括乳脂和含3
GB/T17376—2008/IS05509:2000有乳脂的混合物，未发现有不和脂肪酸的异构化。本方法也适用于含有3.2中所列化学基团的物质，但不能肯定甲酯化是否完全，游离脂肪酸只有70%80%被甲酯化。
含有羟基的脂类会部分生成应的邻中基醚衍牛物，这可能会干扰甲酯的气液色谱分离。因此如样品含有较多羟基，则该方法不适宜，可用气质联用仪分析。气液色谱分析时，柱温低则该方法不适用。另外，该方法不推荐使用极性固定相。分析短链脂肪酸(C～~C)时若样品中不含戊酸建议使戊酸甲酯作为内标物。4.3试剂
所有试剂均为分析纯。
4.3.1甲基寂丁醛。
4.3.2三中基氢氧化硫甲醇溶液20.2mo1/1.。4℃时，该落液在密闭试管内可保存2个月以上，注：如有制.制备方法参见参考文献3]。4.3.3内标储备液：仪用于丁酸或己酸测定。称取大约250mg（精确至0.1mg)戊酸甲酯于50mL容量瓶中,用异辛烷溶解并稀释至刻度。4.3.4内标参比液：仅用于了酸或己酸测定。取10mL储备液（4.3.3）于100ml.容量瓶巾，用异辛烧稀释至刻度。计算浓度(见附录A的第A.8章)。4.3.5油醚。
4.3.6水硫酸钠。
4.4仪器
实验室常用仪器，以及下列仪器：4.4.1试管：2 mL,具磨目玻璃塞，或螺旋口白动进样瓶。4. 4. 2 移液管;1 000 μL
4. 4. 3容量瓶:50 ml,和 100 mL。4.4,4滤纸。
4.4.5旋转蒸发仪。
4.5试样制备
试样应为液体且无水、透明，按照GB/T15687制备试样。如需加热样品，则采用刚好高于熔点的温度。
4.6步骤
4. 6. 1试样
称取10mg士2mg样品于试管(4.4.1)中。如果样品含水量较高.适当增人称样量。对固态样品，在约高于10℃的温度下加热使其融化。避免温度过高加热：用石油醚（4.3.5）溶解样品，加人无水硫酸钠（1.3.6）下燥30min，然后用滤纸过滤，再用石油醚洗涤残渣数次，用璇转蒸发仪（1.4.5）回收溶剂。
4. 6,2甲酯制备
4.6.2.1用移液管（1.1.2)移取500μL甲基叔丁醚加入到试样中以溶解试样，如有必要可轻微加热，测定丁酸或已酸时，则移取500μL内标参比液（4.3.4)代替甲基叔丁醚。4.6.2.2用移液管（4.4.2)加入250uI.三甲基氢氧化硫（TMSH)溶液（1.3.2），猛烈振摇30s见附录A的第A.7章）。
4.6.2.3所得溶液（1.6.2.2）即可用于气相色谱分析，气化室溢度牟少要250℃。（见附录A的第2）基氢氧化碗可由Macherey-NagelGmbH公司购买，提供此信息仅尽为了方便本标准的使者，而不是对这些产品的认可。
GB/T17376—2008/ISO5509:2000A.2章和附录A的第A.7章），如果需要稀释，使用甲基叔丁醛（4.3.1)和甲醇混合液（9+1)，以避免三中基氢氧化硫(TMSH)析出。
5酯交换法
誉示：方法中涉及到危险试剂的使用。应采取适当的防护措施以保护眼晴，并避免瘤蚀性化学物品灼伤的危险。氢氧化钾溶液有毒。5.1原理
将油脂溶解在异辛烷中，加人氢氧化钾溶液过酯交换甲酯化，反应完全后，用硫酸氢钢中和剩余氢氧化钾，以避免甲酯皂化。
5.2范围
本快速方法适用于四碳或四碳以上，游离脂肪酸（FFA）含量不人于2%的食用油脂，也适用于用内标-气相色谱法测定酸或己酸。
样品中如游离脂肪酸含量较高，应过量使用氛氧化钾溶液。由丁游离脂肪酸及其盐不被氟氧化钾酯化，所以本方法只能使样品中甘油酯部分生成甲酯。本方法也适用于含有3.2中所列化学基闭的物质，似不能肯定甲酯化是否完全。5.3试剂
除有特殊说明，均为分析纯试剂。5.3.氢氧化钾甲醇溶液：约2mol/1。将13.1多氢氧化钾溶于100mL无水甲醇中，可轻微加热，加入无水酸钠干燥，过滤，即得遥清溶液。溶液储存一段时间后，可能会形成少量沉淀，用上清液测定不影响使用。
5.3.2异卒烷（2,2,1-三甲基戊烷）：色谱纯，见附录A的第A.2章。5.3.3硫酸氢钠。
5.3.4内标储备液：仪用于「酸或己酸测定。称取大约250mg（精确至0.1mg)戊酸甲酯于50L穿量瓶中，用异辛烷(5.3.2)溶解并稀释至刻度。5.3.5内标参比液：仅用于丁酸或己酸测定。取10mL储备液（5.3.4）于100ml容量瓶中，用异辛烷(5.3.2)稀释至刻度，计算浓度（见附录A的第A.8章）。5.4仪器
5.4.1试管：5mL，具磨凹玻璃塞。5.4.2移液管或移液器：1ml..
5.4.3微量移液管：200μl。
5.4.4玻璃瓶：具螺旋盖，至少4mL。5.4.5容量瓶：50ml.和100tmL。5.5试样制备
试样应为液体H无水、透明，按照GB/T15687制备试样。如需加热样品，则采用刚好高于熔点的温度。
5.6步骤
5. 6. 1试样
称取试样60mg至具塞试管(5.4.1)中，如需测定I酸或已酸，精确至0.1mg。5.6.2甲酯制备
5.6.2.1用移液管或移液器（5.4.2)移取4ml.异辛烷(5.3.2)溶解试样，必要时可以微微加热使试样溶解。测定1酸或已酸时，用移液管（5.4.2)移取4mL内标参比液（5.3.5)代替异辛烷溶解试样。5.6.2.2用微量移液管（5.4.3)加入200L.氢氧化钾中醇溶液（5.3.1)，盖上玻璃塞猛烈振摇30s后静置至澄清。
GB/T17376—2008/IS05509:2000向溶液中加人约1g硫酸氢钠（5.3.3），猛烈嵌摇，中和氢氧化钾。5.6.2. 3
待盐沉淀后，将含有中酯的上层溶液倒人1m1.玻璃瓶（5.4.1)中，得到的异辛烷溶液中甲酯5. 6. 2. 43
含量约为15tmg/mL，并按照以下几种方式注人气相色谱仪：a）直接取一定量注人填充杜（见附录A的第A.5章）；先用异辛烷适度稀释再注入毛细管柱（见附录A的第A.6章）；b
c）对于毛细柱，特殊情况可使用沸点更低的庚烷稀释。6精密度
附录1B中给出了国际实验间对3种甲酯化法的比对测试数据，因为甲酯制备过，色谱柱的选择，气相色谱条件及气相色谱仪器对重复性值和再现性值有影响，所以重复性值和再现性值并未计算出。
A,1三氟化硼的制备
（规范性附录）
主要的分析程序
如果必须制备一氟化硼甲醇溶液，过程如下：警告：操作在通风橱中进行。
GB/T 17376--2008/ISO 5509:2000在2L烧瓶中加入1L甲醇溶液，称取质最后放在冰水浴中冷却。保持烧瓶在冰水浴中，让钢瓶中的三氟化硼通过玻璃管导人甲醇溶液中。为避免液体问流到气体系统，在玻璃管浸入甲醇溶液之前至移去为止，都应通以三氟化硼气体。气体流速不能太人，不能产生白烟。该试剂可在冰箱内保存2年，
A.2试剂
各种试剂不能对气相色谱分析中的脂肪酸甲酯的山峰有干扰。在甲酯气相色谱中，某些试剂在图谱中可能会产生一些不可预见的峰。特别是经过长时间储存，三氟化磁甲醇溶液会生成一些组分影响CC胎肪酸区域的出蜂。因此，每批新试剂或溶剂都应制备纯油酸的甲酯，并进行色谱分析。如有额外峰出现，则这批试剂应当舍弃。
A.3皂化
以葩麻籽油为例，该油样溶丁甲醇，将不会观测到油滴因此溶液澄清与否不能作为反应完全的证明。A,4不化物
不皂化物没有被去除，如果把它计算到物质总量中，它可能会影响到分析结果。如果是这种情说；有必要按照下面描述的操作对方法进行补充，可用蒸水稀释皂化液，并用乙醚、已烷或石油醚萃取除去不.皂化物，然后将其酸化并用异辛烷或已烷提取脂肪酸。制备甲酯按3.6.3或4.6.2执行。A.5甲酯溶液的储存
所制备的甲酯应尽快分析。可将甲酯溶液在惰性气体保扩下储存在冰箱中。若储存时间较长，可添加一定浓度而不会干扰分析结果的抗氧化剂来防止甲酯自动氧化，例如：0.05g/L的2,6-二救丁基对甲酚(BHT)溶液。如中酷中含有丁酸盐甲酯，应储存在密封安瓶中，采取一定的防护措施，以避免衣填充及密封安瓶瓶过程中的蒸发损失。
A,6干甲酯的储存
干中酯应立即分析。若有必要，在情性气体保护下可在冰箱内保存24h，或在真空密封管内于冷藏库中储存更长时间。
A.7 三甲基氢氧化硫(TMSH)法
游离脂肪酸与兰甲基氢氧化硫形成相应的盐，在气化室分解转化成甲酯及二甲基硫化物。GB/T17376—2008/ISO5509:2000为了防止堵塞，毛细管柱的分流口内径应较宽。如堵塞，可加热或用溶剂冲洗清洁。如果用戊酸甲酯做内标物，可用甲基叔丁醚（0.mg/mL～1.0mg/mL）溶解。A. 8
甲醋的量
如果用内标-气液色谱法定量测定胎肪酸，必须精确称量试样的质量（精确到0.1mg）：结果将以油脂脂肪酸组分占据油脂的质量分数表示，这与从内标归一化法获得的结果是不-致的。附录B
(资料性附录）
联合实验室的测试结果
GB/T17376—-20a8/ISO5509:20001995年开展了·--项国际合作研究。在这次测试中，有8个实验室参与测定8份不同的游离脂肪酸样品。这个实验的月的是确定制备中酯的3种于法对于品种不同和游离脂肪酸含量不间的油脂的适用性。表B.1至B.8列出了测试结果，包括各实验室所测主要胎肪酸的最小值、最人值、平均值及标准偏差，
表 B. 1 精炼椰子油(游离脂肪酸含量 0. 03%)三氟化翻法（7个实验室）
脂肪酸甲酯
C 15 : 0
C 20 : 0
最小值
三甲基氢氧化硫(TMSH)法(6 个实验室)脂肪酸甲酶
C 10 : 0
C 16 : 0
C18: 0
C18 : 1
C20 : 1
最小值
最大值
华均值
平均值
标偏差
标准偏券
GB/T 17376—2008/1S0 5509:2000酯交换法（?个实验案）
脂肪酸甲酯
C18 11
C 2G + 0
C20 : 1
三氛化法（7个实验室）
脂肪酸甲酯
C18: 0
C 18 +1
C18 : 2
C 18 + 3
C221 0
C24: 0
最小值
最小值
表B.1（续）
最大值
平均值Www.bzxZ.net
精炼大豆油（游离脂肪酸含量0.06%）最大值
三甲基氢氧化硫(TMSH)法(6个实验室)脂肪酸甲酯
C 14 : 0
C 16 : 0
C 16 1
最小佤
最大值
平均值
平均值
标雅偏差
标偏差
标准偏差
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