本标准规定了牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。 GB/T 20766-2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T20766-2006 标准下载解压密码：www.bzxz.net

牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇玉米赤霉酮、烯雌酚、已烷雌酚，双烯雌酚残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T20766—2006
本标准规定了牛猪肝肾和肌肉鼠织中玉米赤露醉、玉米冰痛徽已烯雌酸、已烧雅粉、双烯班残留最液相色谱-出联质谱测定水法
本标雅适用子牛猪旺肾和肌陶维织中玉求求爆醇，玉米赤萄，已烯璀酚、百烧雌盼、双桥雌粉残留望的测定，
本标准的方法效出限猎吓肾
包烯雅粉和双烯妞粉为吗！
规范性引用
下列文件的条款通过本标的成为本标准酸的修议单（不包居街颜的内容）诚不思漆标推
是否可使丽这
GB/T 63
(e3, T 6379.
G3/T6379
牛的最新版希
测量方
264.1so5725
测盈方法
性与再现注的囊恋变法（GB/T
GB/T 6682
板实验家厂
3源理
，玉米霜烷雌龄为0.5社g/kg，
邀是注调期的引谢文件其随后所有意励根据本标准这成协议的各方研究新版车适用订本标准。
巢的准确度（正樊
2004.ISO5725-
密度）
第1部分：总赠与定义
第2部分确定标准测量方法五复
1992.ncs96.1987)
试样中韶的派能苏酸、辣泰等酮、已烯罐粉、包烧雅酸双烯動用戒丁基甲水和乙酸盐缓冲溶液划医解剂分别提最症胶同相萃最性净化后液缩，用波相色谱单联质谱仪测定，保留时间和陶了非度比定性，内标法定
试剂和树料
除另有说明外，所用试剂均为分极纯·水为GB/T6682糖定的级水。4.了双了基中基链：色谱纯。
艺酸：优级纯。
Z酸纳钠(CH,COONa-3H.O)。
4.4乙酸盐暖冲液：0.2110l/L.PH=5.2。取2.72么酸（4.2)和12.95各乙酸钠(4.3)游解于800mi.水中，用氧氧化钠溶液（4.6)调节0H值蒸5.2主0.1,加水定睿垒1000ml。4.5氢氧化钠：优级纯。
氢氧化溶液：3mol/1。称取120g氢氧化钠（4.5)溶于1000mL去子水中。甲醇：色谱纯。
GB/T 20766--2005
4.8 Z購:色谱
4.9乙酸乙酯：色谱纯，
4.10正已烷：色谱纯。
4.11二红甲烷：色谱纯
4.12溶辉液：正已烷+二氮申烷（60十40）。盘取60mL正已烷（4.10）与40L二氛用烷（4.11）混合：
4.13淋洗液：乙酸乙酯十正已烷（6十94）。量取6mL乙酸乙酯（4.9）与94mL正己烧混合。4.14洗脱液：乙酸乙酯+正己烧（60+40）。量取60mL乙乙酯与40mL正已烷混合。4.15β-葡糖苷酸酶;H-2 型.含 -葡糖苷酸酶 124 400 units/nzI硫酸酷酶 B 610 units/mL4.16激素及代谢物标准物质：玉米赤醇（包括-玉米赤醇和8-玉米亦群醇，各50%），纯度≥97%：玉米亦露翻，纯度≥97%；已烯雌盼，纯度≥99%；已烷性酸，纯度≥98%；双烯雌盼，纯度8%。
4.17激索及代谢物标准溶液：分别滩确称取适冕的玉米赤霉醇、玉米赤露萄、已烯雌酚、双烯瞻爵和已烷雕标准物质，用甲醇（4.7)配制成1.0mg/mL标推储备溶液。再根据需要以用醇记制成不同浓度的混合标推溶羧作为标雅工作溶液，保存于1℃冰箱中，可使用三个月。4.18内标标准物质：氛代玉米亦醇（包括~-玉米赤露醇-4尔代和β-玉米赤联醇-4氢代：各50%），纯度老99%;己烯雌-8氛代.纯度冷98%。4.19内标标准溶液：准确称取适最玉米亦筹筹-1氛代和己烯惟酪8翁代标准物质，用甲醇分别配制我1.0mg/mL内标标准储备溶液。再以甲醇释成与5ng/ml玉来和己烯峰面积或终高相当浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用三个月。4.20硅胶固相萃取桩：500mg，3mL。使用前用5ml.旺巴烷分两次须洗硅胶柱.流邀均为4mE/min:
4.210.45(m滤膜。
5仪器
浚相色谱·串质谱联用仪：有大气压化学电离源。5.1
5.2分析天乎感量0,1mg称0.01g。5.3自动阖相辈聆仪或同相蓝取装。5.4高速均质器：转速大于10000r/min。5.5氮气液缩仪，
5.6病漩振荡器，
5.7离心桃：转速大于3000/m。
5.8PH 计:测垫梢度±0.2 PH 单位5.9具率试管:25nl,50mL。
5.10微量注射器：25μ,100μ。6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取有代表性样品500g、绞碎后搅择均勾，制成实验室荐品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并微工标记：
6.2试样保存
制备好的斌辩置于一18℃袜板保存。2
7测定步骤
7.1基质混合标准溶液的制备
7.1.1，试样的称取
GB/T 20766-—2006
称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.01g），登于50mL离心管中，分别加入不同量合标准工作搭液（4.17），使玉米赤露醇.玉米赤期利已烷雌酚的浓度为1.25ng/tmL，2.5ng/ml.5.0ng/mL.12.5ng/mL、25ng/mL：已烯罪盼和双烯雕的浓度为2.5ng/ml,5.0ng/mL、10ng/tnL、25ng/rnL、50ng/mL。再分别加入适量内标标谁溶液（4.19），使内标物浓度均为10 ig/mL。
7.1.2提取
加人20m.版基甲基醚（4.1).在10000r/min转速下高速均质（5.4)1nin。3000z/min离心（5.7）51min，将上清获全部转稳至另一50nL具塞试管（5.9)中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加人15mL乙酸盐缓冲液（4.4），高速均质1min,3000r/min离心5min，将上清液全部转移至男25ml具试管（5.9）中，并在氮气浓缩仪（5.5）上于40%℃水浴中吹去线余叙丁满印基醛后，加人803谢苷酸海（4.15)混勾，于52℃烘箱中放置过夜。在此绶冲游液出加人然氧化锅溶液（4.6)将游液H值调至7，加人10mL基甲盐融，充分合，3000r/min离心21nin。移取」基甲基避层与施述的叔丁基甲基髓提取液混含，在氮气浓缩仪上于10水浴中吹十。加入「mL溶解覆【4.12），涡旋30：游解，待净化：7.1.3净化
把样液转入硅胶固相萃取杜（4.20）流为2m1.ruin，延样品试管中加人3m1.淋洗液（4.13）.混合后过袜，流遂为2m/mia用3mL洗液以3mL/mn的速度游洗，加入2mL空气以4mlmin的速度吹过碟胶样。用6mL.洗脱液(4.14)洗脱，流速为2mL/min，加人2mL空气以6L/min的速度吹过催胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40℃水中吹干，期人2L流动柏满旋30.5浴解。落液经滤膜(4.21)过滤后·供液相色谱·中联质谱测定。7.2试群溶液的制备此内容来自标准下载网
称取待测样品5g（精确到0.01g）于50ml.离心管中，加入内标标准工作溶激.使内标物含量均为2.0μg/kg。按7.1,2利7.1.3操作7.3空自基质溶液的制备
称阴性样品5<猜循到0.01)于0 tnL惊色离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：ZORBAXEelipseSB-C3.5 μtn.150mm×4.6um或相当者：柱溢：25%
流动相：乙册+水（70+30）；
流速：1.0mL/min
进样量：50以L。
7.4.2质谱案件
a）离子化方式：大气服化学电离：b）扫描方式：负离于扫播；
检测方试：多反应盗测（MRM)：e
）离子源度：325℃
雾化气压力：0.1035MPa
气究气压力：0.0690MPa：
GB/T 20766—2006
辅助气压刃:0.241.5 MPa
喷雾器电流：5uA；
电喷雾电压：4500V
！定性离子对、定盈离子对碰撞气能超和去殡电压，见表「。表1五种激素及代谢物的定性离子对、定邀离子对、碰織气燃和去簇电压药物务称
玉米宗醇
玉米弥辞阴
五米赤霉醇-4筑代
己烯呢
双烯酸
己烷馅酶
已烯熊阁-3
定性离汀对(m/2)
321.1/277.2
331.1/303.2
319.3/205.1
819.8/60.0
7.4.3液相色请沸联质谱测定
7.4. 3. 1 定性测定
你种被测组趣探1个母商
保留耐间之比：位就是祖对保留时之内：祥品谱菌中客经
楚性改
定显离于对(m/α)
321.1/277.2
19.3/205.1
325.1/263.
269.0/134.0
子离子，在概
离于的相对半设进行化若偏盏
造装家
相难肉子宇度
允许的最大偏差
7.4.3.2定邀测定
碰换气能置
去簇电压
蔡件下，样間中待测物质和内标物的底的相对保留射间偏差在击2.5%质标准校准溶胶谱图中对应的定性荒为样品中行在对应的待物。
定性确证时相对离子丰度的最关充许痛差22050
在仪器最佳工作条件下，基质混合标理溶液（7.1)分别进样，以工作溶液浓度为横坐标，蜂而积为织坐标，绘制标准工作曲线。采用内标法进行定整测是。样晶溶液中玉求霉醇、包烯蜓谢、己烷雌丽和双烯唯盼激紫的响应值应在工作画线范围内。在上述色谐条件和质谱条件下，标准物质液相色谱-串辨质谱的多反应监測(MRM)色谱参见斑A.1。本方法的添加间收率数据参现渐录13。7.5 平行试验
按以上步骤，对同一试样逊行平行试验测定。7. 6 空白试验
際小称度试样外，均按遂步骤同时完成空白试验。4
8绰果计算
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试样中被测物的测定结果可的数处理系统按内标法良动计算，也可按式（1)计算：会×≤×会×x
式中：
×1000
X——试样中被测物残留量，单位为微克筹于究(μg/kg)；c一-基质标准工作落液中被測物的浓度，单位为纳克每升（g/mL）；A-—试拌溶液中被测物的色谱峰面积A.—基质标准工作溶中被测的爸谱峰面积；试样熔液中内标物的浓度单位为纳每L：C
ca——-辈质标矩工作溶液虫两标蜘的浓度，单位为纳克每溶升tg/mL)，As”“基题标推工作溶滩标榜的色谱峰而积；A-—试样液中内桥物舒世增峰而积V——样波最终定容体草位为离
试样溶波所代表试样的质量
注：玉米冰海利己雄游菌球面积或精密度
本标准的精欲楚数瘤提按照G
以95%的可信度来到
9. 1眞堡性
在车复性试验给健厚获得的尚次攀醇、玉来水鲜阳、已烯蹈粉、巴烷雌如果您值超过最造眼，应舍穿
9.2再现性
在再现性试验条作器得的两次
掌醇、正米亦馨铜、已烯湘粉食烧雌醇到
章新完成两次
值的和
.--(1 )
确定的，更您性和再现性的信
复性限猪组织中玉农办
程地装3。
的测定。
再现性限象，牛猎纸织中“米赤就强见装3
衰3含盈范围及量登程和再现性方程化合物名称
玉米赤学阳
玉来赤翠阴
把淤跳醇
双烯啡
已烷噬弼
含量范国：ke）
0.25---5.00
0. 50~-10. 00
0. 50 --10. 00
0. 25 -5. 00
定：为两次测宽果的算术乎均们。读复性限”
gr=0.0G96lgm--0.732.6
g4h 1 188 8 1 3-0. 593 0
Ig r=1. 010 8 lg nt -0.873e
[g0r510xeg=0. 200 8
Igr-0.9646lgm-0.779
鹤现性限
ig P% 0. 815 2 1g m -0. 631 3AgR1.2064gm0.6193
1g R-1. 084 6 lm m-0. 562 1
lgR0.8781lnm-0.2471
Ig R=0. 908 8 1g m—0, 447 35
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附蒙A
【资料性附录】
玉米球霉醇、玉米弥露醇、己烯雕酚、己烷雄、双烯雌酚标准物质及玉米赤馨醇-4氛代、已烯雌酚-8氙代内标物的多反应监测(MRM)色谱图玉米赤露醇、玉米赤露酮、已烯跳黔、已烷雌粉、双烯雌酚标推物质及玉来赤霉醇-4尔代、巴烯雌酚8氛代内标物的多反应监测(MRM)色谱图，图A.1：Susausne
slssura
Mahaosua
玉米苏猴牌
a）玉来麻练萨
321.1/277.2
319.3/20元.1
h）玉米新猴阴
玉米办念醇-4双代925.1/236.1
正来赤密醇代
）已烯堆
已烧赚粉
双烯雕
已烯87.0/22！
已盗能尚269.0/134.0
双端龄：265.0/235.1
已烯能附-8张代 257.1/24F.0
g已烯雌盼-8尔代
图 4.1玉米赤醇、玉米弥霉酮.己烯雌酚.已烧雌酚，双烯雌酚标准物质及玉米赤露醇-4氛代、巴烯雌酚-B代内标物的多反应监测(IMRM)色谱图附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T 20766-2006
五种激素及代谢物添加浓度及其乎均回收率的试验数据，见表B.1表B.1五种激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据微销名称
玉米赤醇
玉米东翠关
双能院
迎烷雅酚
涨加液度/(μg/kg)
平均回收率/（%）
101,00
92, 47
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