本标准规定了诊断依据、诊断原则、诊断标准和鉴别诊断。本标准适用于全国各级各级医疗、卫生、疾病预防控制机构及其工作人员对本病的诊断和报告。 WS 285-2008 流行性感冒诊断标准 WS285-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS11.020
23226—2008
中华人民共和国卫生行业标准
WS285—2008
流行性感冒诊断标准
Diagnosticcriteriaforinfluenza2008-02-28发布
人民卫生幼版站
雨水万头
2008-09-01实施
中华人民共和国宝卫生都发布
术语和定义
诊断依据
诊断原则
鉴别诊断
附录A（规范性附录）流感病毒分离培养和鉴定方法附录B（规范性附录）红细胞凝集抑制试验附录C(规范性附录)微量中和试验..
附录D(规范性附录)流感病毒核酸检测方法附录E(规范性附录)免疫荧光法检测方法次
附录F（资料性附录）流行性感冒病原学、流行病学和临床表现附录G（资料性附录）流感标本的采集、运送和处理规程WS285—2008
根据《中华人民共和国传染病防治法》制定本标准。WS285-2008
根据国家质检总局国家标准委公告（2005年第146号），GB15994—1995《流行性感冒诊断标准及处理原则》自本标准实施之日起废止。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E是规范性附录，附录F、附录G是资料性附录。本标准中卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：舒跃龙、郭元吉、余宏杰、张烨、徐翠玲。m
1范围
流行性感冒诊断标准
本标准规定了流行性感自的诊断依据，诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构和人员对流行性感日进行诊断，报告。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。流感病毒分型type of influenza virus2.1
WS285—2008
根培流感病毒核蛋H（NP）、MI蛋H抗原性和基因特性的不同分为甲（A）、乙（B）、内（C)三型。2.2甲型流感病毒亚型subtypeof influenzaAvirusI型流感病毒根据其表面的血凝素（H或称为HA）、神经氨酸酶（N或称为NA)抗原和基因特性的不同又分为多个亚型。至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型（II1~II16），神经氨酸酶有9个业型(N1~-N9)。
2.3流感样病例influcnza-likeillness发热，伴咳嗽或咽症之一者。
3诊断依据
3.1流行病学史
在当地流行季节（如我国北方的冬春季，南方的冬春季和夏季），一个单位或地区集中山现大量上呼吸道感染患者，或医院门诊、急诊上呼吸道感染患者明显增加3.2临床表现
3.2.1道常表现为急起高热（腋下体温38℃）、畏寒、头病、头量、浑身酸痛、乏力等中毒症状及咽痛干咳等呼吸道症状，但卡他性症状常不明显。3.2.2少数病例有食欲减退，伴有腹痛，腹胀、呕吐和腹冯等消化道症状3.2.3少数病例也可并发鼻窦炎、中耳炎、喉炎、支气管炎、肺炎等，甚至会呼吸循环衰竭而死亡。3.2.4在两岁以下的幼儿，或原有慢性基础疾病者，两肺可有呼吸音低，湿啰音或哮鸣音，但无肺实变休征。
3.2.5重症患者胸部X射线检查可显示单侧或双侧肺实质性病变，少数可伴有胸腔积液等。3.2.6外固血象白细胞总数不高或偏低，淋巴细胞相对增加，重症患者多有细胞总数及淋巴细胞下降。
3.3实验室检查
流感标本的采集、运送和处理规程参见附录（。3.3.1从患者呼吸道标本中分离和鉴定创流感病毒（见附录A)。3.3.2患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上（见附录B和附录C)。3.3.3在患者呼吸道标本流感病毒特异的核酸检测阳性（见附录D）或检测出特异的抗原（见附录E）。3.3.4采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，流感病毒特异的核酸检测阳性（详见附录D)或检测出特异的抗原（见附录E）
4诊断原则
如果在非流行季节仅根据临床表现，流感很难与其他病原体，尤其呼吸道病原体导致的疾病区别，1
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对流感病例的确诊往往需要实验室的诊断依据。但在流感流行季节，当地一个单位或局部地区出现人量上呼吸道感染患者或医院门诊、急诊上呼吸道感染忠者明显增加时，具备相应临床表现的可作为流感临床诊断病例。流行性感冒病原学、流行病学和临床表现参见附录F。5
临床诊断病例
具备3.1和3.2中任何一项临床表现者。5.2确诊病例
5.2.1流感样病例并具备3.3中的任何一项者。5.2.2临床诊断病例并具备3.3中的任何一项者。6
鉴别诊断
在体征工很难与多种病毒如呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒等引起的上呼吸道感染进行鉴别，鉴别诊断主要依靠病原学、特异核酸检查和血清抗体测定。2
A.1病毒的分离培养
附录A
（规范性附录）
流感病毒分离培养和鉴定方法
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流感病毒的分离培养主要采川MDCK细胞和鸡胚培养方法分离病毒，具休技术如下：A.1.1MDCK细胞分离病毒方法
A.1.1.1MICK细胞培养技术
A.1.1.1.1生物安全级别和生物安个规定MIXCK细胞培养实验室生物安全册，生物安全一级实验室，应该遵守生物安全实验室相应的生GHot
物安全规定。
A.1.1.1.2细胞培养的所
a）生长成片的Mck命胞；
b）无菌的T-25勿胞养瓶；
c)D-MEM培养没：
d）青霉素、链带系母液（10000U）mL青素：10.000ug/mL硫酸链霉素分装后保存于一20℃；7.1mol/L母液
IIEPES缓冲液
f）胎牛血清
53mmol/L.EDTA·4Na），分装后保存丁g）EDTA-睡酶（O
05%胰酶：0.5免费标准bzxz.net
h）牛血清白蛋口组分V.7.5%溶液，i）1mL、10mL无菌移液管；
D70%~75
建议：要求经常检
查试剂使用的有效期
A.1.1.1.3培养基
剂的准备
a）含L谷氨酸的D
500mLD-MEM
MEM培养液的准备（用于MDCK细胞培养）校中加人：
子液5mL（终浓度达：1000/mL青霉素；100mg/mL链雾素）；1）青霉素，链赛
2）HEPES缓中液5mL（终浓度：25mmol/L）3）7.5%牛血清白蛋白组分V
h）细胞生长液
胎牛血清 10mlL.加到 90ml的选心的液体中,使胎牛血清的终浓度为 10%。A. 1. 1. 1. 4 MDCK 细胞的培养程序这里以T-75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变MIDCK细胞悬液的量必须做相应的调整a）首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA胰酶b）温和地摇动细胞瓶1min.使EDTA胰酶均勾分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰梅。
c）重新加人5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤d）加入1mLEDTA-胰酶使其均勾分布在整个细胞薄层，37C孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表而分离（5min~10min），必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清火活残余的胰酶。
e）加9mL已经配制好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹放细胞跑团。WS285--2008
f）取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）。g）每个T-25细胞培养瓶加人6mL(6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T-75细胞瓶用于细胞传代。通常6ml细胞悬液2d～3d可生长成片（80%~90%）的单层细胞。h）于37℃培养箱甲培养细胞，每天观察细胞状态。A1.1.1.5MIDCK细胞计数方法
用血细胞计数板来精确计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。a）在0.2mL中台盼蓝（0.1%PBS溶液）中加入0.2mL细胞悬液，混匀。没有活性的细胞被染成蓝色。
b）取适量的细胞悬液分两边加入血细胞计数器的计数室）计算计数室四个角上二线包的正方形中的活细胞，压线的细胞不计数。d）如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。e）计算计数室4个角上正方形内的活细胞总数f）用式（A.1)计算每毫升悬液中活细胞的数量。C=TXTbX1/4X104
每毫升内原始细胞数：
T—4个角上正方形内的活细胞数；Tb一台盼蓝的稀释度校正值（稀释度计算为1/Tb）。g）计算稀释系数。
h）用稀释液将细胞稀释到所需的细胞工作浓度。A.1.1.1.6细胞的冻存
a）细胞冻存材料
1）已经生长成片的MDCK细胞：80%～90%成片，细胞生长良好存活率高：2）二甲基亚（DMSO)；
3）胎牛血清；
4）EDTA-胰酶（0.05%胰酶；0.53mmo1/LEDTA4Na)；5）移液管：1mL10mL
b）细胞冻存步骤
1）冻存液的配置：9mL胎牛血清、1mL二甲基亚砜2）细胞消化：消化过程见A.1.1.1.4中的a)～b)；3）细胞消化后，加人配置好的细胞冻存液，混勾后分装到细胞冻存管内：4）细胞冻存浓度为1×10°/mL；5）细胞冻存过程：4℃2h，一20℃2h，放人液氮长期保存。A.1.1.1.7细胞的复苏
冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰品重新结品对细胞造成伤害，而导致细胞调亡。细胞活化后，需要数月或继续传一至二代，其细胞特性才会恢复正常。a）材料
1）37℃恒温水浴箱；
2）细胞生长液：配置方法同A.1.1.1.3中的6)：3）70%~~75%的酒精；
4）移液管：1mL，10mL。
b）细胞复苏步骤
1）将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70%～75%的乙醇擦拭外壁后放入生物安全柜内；
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2）自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，以70%-~75%的乙醇擦拭保存管外部，移入牛物安全柜内；4）取山1.0mlL解冻的细胞冻存感液，缓慢加入事先加好5ml.生长液的T-25细胞培养瓶内：混合均勾，放人37℃培养箱培养：5）次月，规察细胞形态，并月更换细胞生长液，A.1.1.1.8MLCK细胞系的敏感性的检测在对量传代的情沉况下，MIDCK细跑可能会失去其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传15代~-20代，达到40代以上时，需要进行敏感性测定，测定时选择已知TCID的病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体等污染。选择己知TCID品的流感病毒，在同一条件下分别感染早代（小于30代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID测定。如果测试的TCID比早代的低2个或以上Ig，表明其对病毒的敏感性口下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个，表明可继续使用。A.1.1.2流感病毒的MDCK细跑分离标准操作规程A.1.1.2.1试验材料
a）已经75%～90%成片的MDCK细跑，选用T-25人小的细胞培养瓶来川作病毒分离：b）TPCK处理胰酶（牛胰腺米源训型）：e）HEPES缓冲液，Imol/L液；
d)D-MEM培养基、Hank's液；
e）青霉素、链霉素母液（10000U/mL青霉素，10000ug/mL硫酸链霉素）；1牛血清白蛋白组分V.7.5%溶液
g）临床样品0.5InL（标本的采集及处理方法参见附录C）；h）lmL无菌移液管；
i10mL无菌移液管。
A.1.1.2.2培养液和试剂的准备（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）a）细胞维持液
500mLD-MEM液中加人：
1）青霉素，链霉索母液5ml（终浓度达：100L/mL青霉索，100ug/ml链素）；2）牛血清白蛋白组分V12.5ml（终浓度：0.2%）；3）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度25mmol/L）b）病毒生长液
每500ml.细胞维持液中加人0.5mI.的TPCK-腹酶（母液浓度为2mg/ml)使TPCK-胰酶的终浓度为2ug/ml.
A.1.1.2.3流感病毒细胞分离程序所有有美流感病毒分离的操作都应在生物安全Ⅱ实验室中的生物安全柜里进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。a）75%~90%成片细胞的准备
1）用40倍物镜镜观察细胞生长状态。选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。2）轻轻倒山细胞生长液，用6mLHank's液分别清洗细胞3遍。b）细胞培养瓶的接种
1）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出；2）用无菌的移液管吸取200L临床样品置于细胞培养瓶中，温和摇动数次；WS285—2008
3）37℃培养箱中吸附1h~2h；
4）吸出接种物，用Hank's液清洗细胞，清洗2次，然加人6mL含2ug/mLTPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中；
5）放置于33℃~35℃培养箱培养；6）每日观察细胞病变情况（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大；细胞核固缩或破裂：严重时细胞部分或全部脱落）。c）细胞培养物的收获
1）当75%~~100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞冻融1次~2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获。2）进行红细胞凝集试验（HA），HA≥8的进行病毒的鉴定（具体方法参见流感病毒的鉴定技术中的HA试验和HI试验部。如没有红细胞凝集现象，应继续言传1次～2次。HA试验仍为阴性者，认为MDCK
示本按生物安全有关规定进行处理。对于细胞病毒分离阴性，标
物继续进行细胞传代，直至HA≥8时再进行病毒的鉴定。连续传代2HA≤8的细胞分离物
次以上，HA仍
8的细胞分离物，可以采用RT-PCR或者Real-TimePCR方法进行核酸检测。
3）HA≤8的细胞分离物的传代方法与与标本相同。
10-、10
10-\稀释后，再感架细胞！
于32时选护
HA≥8进行细胞传代时应将病毒液进行具体的稀释浓度与HA的滴度有关。一般滴度小10-倍稀释；滴度大于32
以上时选择10-或10-”稀释。
A.1.2鸡胚分离病毒方法
A.1.2.1试验材料
a）9日龄～
b）照卵灯；
1日龄鸡胚；
c)70%~75%z
d）一次性注射
e）鸡卵开孔器
f）融化的蜡或股水
g）10mL管和警
h）10mL移液管
i）无菌镊子。
A.1.2.2流感病毒鸡胚分离程序
所有有关病毒分离的操作都应在生物安全二级实验室生物安全柜中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物育理规定。进人生物安全二级实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。
A.1.2.2.1验卵
a）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。b）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。如何判断鸡胚状态
1）血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块。2）胎动：活胚有明显的自然运动，但是人于14d后胎动则不明显；死胚无胎动。3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。A.1.2.2.2鸡胚接种
a）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚b）用70%～75%乙醇消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10mm×6mm裂口。6
）用注射器吸200L处理过的临床标本，装上16号针头。WS285—2008
d）从裂口巾滴入无菌的液体石蜡：然后轻轻晃动鸡胚：让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开此时在照卵灯下即可清楚的看创鸡胚胎的位置。将注射针头刺人胚胎的聘下胸前用针头轻轻拨动下聘及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拔动而动，即可注射100让临床标本。将针头退出至1/2寸：将另外100元L临床标本注人鸡胚尿囊腔。）川同一注射器和针头将同一标本依上法接种刃外两枚鸡胚。）将针头充丁合适的生物安全装置中。g）用消毒过的医用胶布封口。
h）33℃~35℃温箱培养鸡胚2d~3d。A型流感病毒培养2d，B型流感病毒培养3d.呼吸道标本标本培养31。鸡胚进行病毒分离培差时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是A132OUSE
非特异死亡应充去。
a）鸡胚在收获前应1℃过放或至少做置b）标记15mL无菌塑料管与相应的鸡肝编号用
～75%醇消毒鸡胚顶部。
环气空蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10mL吸管吸孜鸡小尿衰液置于相应的收c）用无菌镊子撕破鸡肚
正车膜，尽量吸取羊水放置于另外的管集管中，刺破鸡肚
水合并。
d）将鸡胚收获液
感病毒的
标本，应再
特性)。
的鸡胚分
000r/min离心5min去除血液和细胞术中的IIA试验部
。羊水较时也可以将3个鸡豚的羊进行红细胞凝集试验（具体方法参见流的进行病毒的鉴定。如有红细跑凝集现象的鸡胚传代2次（对于“O\相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中牛长的为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理。对丁IIA≤8HA滴度仍为
继续进行鸡胚传代，直至HA8时再进进行病毒的鉴定。连续传代2次以上，HA仍小于8的细胞分离物，可以采用RT-PCR或者Real-TimePCR方法进行核酸检测。e）对于HA8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-10稀释。HA滴度的大
10-3稀释。
A.2流感病毒鉴定
体的稀释度与
小有关。一般滴度小于32时选择10-倍稀释，滴度大于32以上时选择10?或A,2.1流感病毒红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒的血凝素
能够引起红细胞凝集，因此而得名。用于检测流感病毒红细胞凝集活性的红细跑凝集试验就是根据病寿的这可以抑制红细胞凝集的出现
特性而建立的，当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则即为红细咆凝集抑制试验（HI)的理论根据。微量红细胞凝集抑制实验足前最常用的一种鉴定流感病寿的方法。信。用于ITI的标准参照血清必须及时该方法简单，易行、结果可
，人和其他动物血清中含有对流感病毒的非特异性抑制素，因此在进行HI测定之前所用的血清必须经特殊处理以清除非特异性抑制素。A.2.1.1生物安全要求
生物安全要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。A.2.1.2实验材料
A.2.1.2.1当时人群中流行的流感病毒如A（H1V1）、A（H3N2)、B型流感病毒的标准参照抗原与参照血清。
A.2.1.2.2缓冲液和其他试剂
a）红细胞悬液（鸡、火鸡、豚鼠、或人“O\型红细胞，由于“O\相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞或人“”红细胞），b）磷酸缓冲液（PBS）：0.01mol/L：pH7.2。WS285-2008
c）生理盐水。
d）其他
1）37℃水浴：
2）56℃水浴；
3）台式离心机：
4）多道可调加样器；
5）离心管；
6）96孔微量板：鸡，火鸡红细胞选择“V\型底微量板：豚鼠和人“O”型红细胞选择“U”型底微量板。
A.2.1.3试剂配制
a）磷酸缓冲液（PBS）)：0.01mol/L.pII7.2。25×倍PBS母液：2.74gNaIIPO,.0.79gNaIIPO,加去离了水至100mlb）工作液配制：25倍PBS缓冲液完全溶解后，取40mL25倍PBS液，加人8.5gNaCl，加去离了至1000mL，用1mol/LNa0H或1mol/LHCl调整pII至7.2。121℃高压灭菌15min，消毒后至4℃保存
c）生理盐水：0.85%NaCl.
20×丹液：170gNaCl加人1000mL去离子水，121℃高压灭菌15min，消寿后至4℃保存。生理盐水（0.85%）：20×母液50ml加人去离子水950mL121℃高压火菌15min.消寿后至4℃保存。d）阿氏液配制
1）25g葡萄糖；
2）8.5g枸檬酸钠；
3) 4. 5g NaCl;
4）0.55g枸檬酸
加去离子水1000mL，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整pH至6.1，用0.22jm的细菌滤器过滤，或121℃高压灭菌30min，消毒后至4℃保存。A.2.1.4红细胞悬液配制
a）取阿氏液中的红细胞，1200r/min离心5min，弃上清b）加人至少10倍沉淀物的PBS液体洗涤，充分混勾，1200r/min离心5min，弃上清，c）PBS液体按以上方法洗涤三次。最后一次洗涤后，1200r/min离心10mind）将红细胞加人剑合适的PBS中，稀释至合适的浓度，通常为1mL红细胞加入到99mLPBS中（1%）。火鸡、鸡的红细胞，实验终浓度一般为0.5%，如用人“（)”型、豚鼠红细胞，终浓度为0.75%。使用不同类型红细胞进行红细胞凝集试验各项条件比较见表A.1流感病毒红细胞凝集试验各项条件表A.1
红细胞
终浓度
孔底部形状
孵育时间
细胞对照
细胞沉积成点状，倾斜时红胞
向下流成泪滴状
细胞沉积成点状，倾斜时细胞
向下流成汨滴状
A,2.1.5流感病毒红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验操作步骤A.2.1.5.1RDE(受体破坏酶)处理标准参照血清8
人“O\型血
细胞沉积成环状
细跑沉积成环状
wWa）1份血清加入4份RDE，混合；b）37℃水浴过夜；
c）56℃水浴加热30min，灭活RDE的活性。A.2.1.5.2处理后血清中有无残留非特异性凝集素a选用适当的微量板，从B1至H6中加人25uLPBS：b）A1到A5各加50μL处理后的血清，A6加50uLPBS；WS285-2008
c）用多道加样器从A1行开始，各孔取25uL血清，由A行至H行进行2倍稀释清；d）H行各孔稀释混匀后其取25uL；e）每孔补加25uLPBS；
f）每孔加人50uL红细胞悬液，混勾g）置室温（22℃~25℃）30min60min，观察有无凝集，如出现凝集则表示血清中有残余的非特异性凝集素。该血清必须用红细胞吸附去除非特异性凝集素后才能使用。A.2.1.5.3红细胞吸附去除非特异性凝集素a）1体积的红细胞可以去除20倍休积的RDF处理过的血清；h）红细胞与血清混匀后，置4℃，1hc）1200r/min离心10min；
d）小心吸取上清液；
）重复操作直至血清中的非特异性凝集素被去除。A.2.1.5.4红细胞凝集试验（HA)检测待检病毒滴度a）据所用的红细胞种类选用适当的微量板。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1~A12称为A行。b）除第列各孔L外（AI~H1），其余每孔加50uLPBS。c）A1~G1各加100uL标准抗原或待检病毒。H1加100uLPBS作为红细胞对照。d）用多道加样器从第一列各孔分别取50uL病毒液.由第一列至第12列做二倍系列稀释。最后列每孔弃去50uL。
e）每孔加入50u工红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。f）室温孵育30min~60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。g）红细胞完全凝集以“十”记录，只有部分红细胞凝集记录为“十/一”，无凝集记录“一”红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。
A2.1.5.5制备用干红细胞集抑制试验的4个红细胞避集单位的抗原a）一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25mI体积中含有4个红细胞凝集单位）的病毒量。b）制备4个红细胞凝集凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25uL抗原，那么测定一份血清须0.2mL抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原，C）计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度（HA滴度）除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。按1：8（1mL病毒液加7mLPBS）稀释该病毒即可得到1个凝集单位的病毒量/25的抗原病毒量。d）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个凝集单位抗原须复核滴定：取50L稀释好的抗原，用等量PBS做2倍系列稀释（同病滴定）后加人50L红细胞悬液，至室温孵育30min～60min后观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50L病毒含有8个凝集单位（即25uL中含有4个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝
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