WS/T 248-2005
基本信息
标准号： WS/T 248-2005
中文名称：厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法
标准类别：卫生行业标准(WS)
标准状态：现行
发布日期：2005-05-08
实施日期：2005-12-01
出版语种：简体中文
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标准分类号
标准ICS号：医药卫生技术>>11.020医学科学和保健装置综合
中标分类号：医药、卫生、劳动保护>>卫生>>C50卫生综合
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出版信息
页数：14页
标准价格：9.0 元
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标准简介
WS/T 248-2005 厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法 WS/T248-2005 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T248-2005
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法Methods for Antimicrobial SusceptibilityTesting of Anaerobic Bacteria2005-5-16发布
2005-12-1实施
2．引用标准
3．定义
中华人民共和国卫生部
进行厌氧菌敏感试验的指征
厌氧菌敏感试验的局限性
抗微生物药
常规试验和报告中抗微生物药的选择7.
稀释试验接种物制备
9参考琼脂稀释法（Wadsworth法）10.微量肉汤稀释法
11.β-内酰胺酶试验
12、质量控制的方法
附录：培养基和补充剂的制备
表1：厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组表2：解释标准和相对应最低抑菌浓度（MIC）值表3：制备抗微生物药贮存液需要的溶剂和稀释液发布
表4：琼脂稀释法或微量肉汤稀释法敏感试验中抗微生物药稀释液的制备方案表5：参比琼脂稀释试验标质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围表6：微量肉汤稀释试验质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围前言
临床细菌分离中由于庆厌氧菌感染日渐增多，厌氧菌的药敏试验和耐药监测已提到日程上。本标准是在卫生部颁发的《全国临床检验操作规程》（第三版）的基础上，依据美国国家临床实验室标准化委员会（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards,NCCLS）M11-A5文件一厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法（已批准的标准一第五版）[ISBN1-56238-429-5]，结合中国国情及卫生系统的实际情况和要求制定。本标准从2004年月
日起实施。
本标准由卫生部提出。
本标准起草单位：北京大学人民医院检验科。本标准主要起草人：张正岳志红。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。中华人民共和国卫生行业标准
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法MethodsforAntimicrobial SusceptibilityTestingofAnaerobicBacteria
WS/T248-2005
本文件所述方法主要用于测试普通分离到的厌氧菌。琼脂稀释法可用于测试大多数厌氧病原菌。目前微量肉汤稀释法仅用于测试脆弱拟杆菌菌群的病原菌。本标准适用于从事厌氧菌抗微生物药敏感试验的临床实验室使用。2.
引用标准
下列标准条文主要根据美国NCCLS的MII-A5文件和中华人民共和国卫生部医政司编制的《全国临床检验操作规程》（第三版）而制定。3．定义
3.1琼脂稀释敏感试验
将某一种抗微生物药的系列浓度混入用于敏感试验的琼脂生长培养基进行的抗微生物药敏感试验。
3.2敏感
指该菌株所致感染可以用推荐用于此型感染及病原菌的抗微生物药剂量进行恰当地治疗。
3.3中介
药物在生理浓集的部位具有临床效力或者可用高于正常剂量的药物进行治疗：此还包括一个“缓冲区”可以防止微小的，未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。3.4耐药
指常规剂量抗微生物药通常达到的浓度不能抑制该菌株的生长和/或该菌株的MIC落于某范围内。在此范围内，可存在某些特定的耐药机制（如β-内酰胺酶类），并且治疗研究显示其临床疗效并不可靠。
3.5最小抑菌浓度
琼脂或肉汤稀释敏感试验中抗微生物药抑制某一种微生物可见生长的最低浓度。4.进行厌氧菌敏感试验的指征
临床上有厌氧菌感染存在，并在实验室分离出厌氧菌，原则上均应进行抗微生物药敏感试验。
4.1常规试验
从脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、人工装置或人工血管感染和菌血症分离到的特殊感染的标本应该测试，并应参考临床医生的合理建议。当感染的性质不清楚，标本含有内源性厌氧菌菌群，而且病原菌与正在治疗的感染关系很少时，通常不必做敏感试验。当存在多种厌氧菌时，参考临床情况选择可能引起厌氧菌感染的最重要菌种进行敏感试验。一股分离到拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属。梭菌属、嗜胆菌属和萨顿氏菌属的一些菌种应做敏感试验。敏感试验应使用分纯后菌悬液。不能直接用临床标本进行敏感试验。MIC试验一般采用倍比稀释，采用本标准推荐方法，做好质控，结果报告采用在实际终点时的一个倍比稀释范围内较为科学。例如：终点为16ug/mL，真正报告应8ug/ml-32ug/ml范围更好。并做出敏感、中介或耐药判断，以供临床参考。4.2监测试验
当技术条件不允许每个实验室都进行厌氧菌敏感试验时，建议当地建立参考实验室，收集一定量临床菌株（不少于50-100株），集中测试后公布结果供大家参考。5.厌氧菌敏感试验的局限性
体外结果不足以预测某个病人对厌氧菌感染治疗的反应，仅供临床选药参考。此标准的试验方法也并不一定适用于所有的厌氧菌，以下2点需考虑。5.1折点和临床相关
关于确定厌氧菌对大多数抗微生物药的敏感性的折点，现在并无一致意见。目前折点的确定是基于动物模型或需氧和厌氧菌多重感染的病人的临床试验结果。因为大多数厌氧菌感染发生于密闭空间，涉及多种微生物，单一抗微生物药抗单一微生物的体外活性并不直接与其体内效力相关。
除数目分布和临床效力之外，MIC结果的敏感和中介折点解释是基于最大的推荐剂量获得的血清水平，因为厌氧菌感染通常推荐最大剂量用药。建立中介范围是因为有些药物难于判读终点和MIC在折点附近聚集。5.2病原菌
琼脂稀释法适用于测试多种不同的厌氧菌。至今为止，微量肉汤稀释法仅限于测试脆弱拟杆菌菌群。当测试菌呈蔓延生长时（例如艰难梭菌或破伤风梭菌），则需要尽量在琼脂平板上划开接种物。而对于败毒梭菌，每个平板只能测试一个分离株。6.抗微生物药
6.1来源
抗微生物药标准品或参考药品可直接来自厂商，或来自中国药品及食品监督管理局检定所，或其他商业途径。不应把非肠道的制品用于敏感试验。可接受的药品应贴有标签，标明药品的通用名，批号，分析活力（常用每mg药品中含ug或国际单位（IU）表示）和有效期。贮存于规定的温度和湿度中。用时防止冷凝水进入。6.2抗微生物药的称量
实验室必须根据该批待用药品的分析结果来标化其抗微生物药溶液。抗微生物药品应使用经计量认证的分析天平称量。公式如下：重量(mg)-体积（mL）×所需浓度（μg/mL）分析活力（μg/mg）
体积（mL）=重量（mg）X分析活力（ug/mg）所需浓度（μg/mL）
6.3制备贮存液
抗微生物药贮存液制备的浓度一般应该至少为1,000μg/mL(如1,280μg/mL)或者是最高测试浓度的10倍。某些药物必须溶解于非水溶剂中。此时，应使用尽量少的溶剂来溶解抗微生物药。最终的贮存液可用水或表3所述的合适的稀释剂进行稀释。贮存液分装后贮存于规定温度下，一般-60℃可保存半年。6.4测试浓度的数目
一种特定抗微生物药的测试浓度应包含表2所示的解释性折点，但实测的浓度数目是由实验室决定的。MIC结果报告推荐选用五个或更多浓度。建议选用的范围应包涵质控菌株的在控数值。
7.常规试验和报告中抗微生物药的选择敏感试验抗微生物药品种类选择可参考表1。在实际应用中，应结合我国实情，参考实验室所在的临床单位医生及控感科意见做出合适选择，不断积累经验。完整的报告单应包括患者一般资料（姓名、性别、年龄和病理号等）。药品名称应按照我国药典颁布名称。菌种名称按照卫生部已公布名词标准。应报告敏感、中介和耐药。8.稀释试验接种物制备
受试菌应是从强化布氏血琼脂选择经充足时间孵育（24-48小时）产生的合适大小的菌落。菌落直径通常至少1毫米。快速生长菌如脆弱拟杆菌菌群和产气荚膜梭菌可经24小时孵育后测试，而其它大多数厌氧菌需要48小时孵育。对于缓慢生长的厌氧菌，如嗜胆菌属和纤细弯曲杆菌，可以从多个琼脂平板制备接种物以保证标准化的准确。可通过生长法或直接菌落悬液法制备接种物。
8.1制备接种物时的浊度标准
为使敏感试验的接种浓度标准化，应使用一个等同于0.5号麦氏（McFarland）标准管的BaSO4浊度标准管或其光学等同物（如乳胶颗粒悬液）。BaSO4的0.5号麦氏标准管制备见附录。
8.2分离株的贮存和复苏
8.2.1冷冻
大多数厌氧菌可在20%甘油中在-60℃或更低温度保存数年。将四份48小时肉汤培养物转移到含有一份无菌甘油的无菌玻璃瓶中。充分混匀成均一悬液后冷冻。预还原时使用不加糖的疱肉培养基。
另外，也可将48小时平板培养的若干菌落直接悬浮于20%灭菌脱脂牛奶中，-60℃冷冻。8.2.2复苏
冻存的分离株必须在强化布氏血琼脂上至少传代两次，用于敏感试验前必须证明其纯度。
8.3生长法
（1）从强化布氏血琼脂选择经24小时或充足时间孵育产生的合适大小的菌落（直径至少1毫米）。挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，或用3mm直径的接种环取满一环，接种于无指示剂的硫代硫酸盐培养基。如果此步骤使用厌氧箱，可使用强化布氏肉汤，强化脑心浸液或Schaedler氏肉汤替代硫代硫酸盐肉汤。(2)
孵育肉汤6-24小时或直至获得足够浊度。加入布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，调整浊度等于0.5号麦氏标准。对于大肠杆菌ATCC25922或脆弱拟杆菌ATCC25285，此时悬液中细菌数约为1-2×10~CFU/mL。但应注意到不同厌氧菌分离株接种大小的变化。8.4直接菌落悬液法
此法是从孵育了24-48小时强化布氏血琼脂平板挑取菌落。制备悬液时平板在有氧(1）
环境中不应超过30分钟。
轻轻挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，直接转移到布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，获得相当于0.5麦氏标准的浊度。此法制备厌氧菌的一些菌种菌悬液计数会轻度升高。(3）
9．参考琼脂稀释法（Wadsworth法）9.1试剂和材料
9.1.1厌氧罐（箱）
采用环境含4-7%CO2厌氧罐（箱），并应有无氧状态指示剂。9.1.2强化布氏琼脂
使用的培养基是每mL布氏琼脂中添加5μg氯化血红素、1μg维生素K,和5%脱纤维羊血(v/v)。布氏琼脂的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。也可提前配制琼脂，使用当天融化。制备抗微生物药稀释液后，抗微生物药和脱纤维羊血一起加入到融化琼脂中。9.2琼脂稀释平板的制备步骤
开始前，确定抗微生物药及其所用浓度。制备琼脂稀释平板时，15×100圆形平板需要20mL琼脂，方形平板需要30mL。平板的制备是将一份10×抗微生物药溶液加入到九份琼脂中。例如：制备20mL琼脂的圆形平板，需要在17mL已添加氯化血红素和维生素K,的融化的布氏琼脂（保持在45℃-50℃）中加入1mL脱纤维羊血和2mL10x抗微生物药溶液。方形平板则是25.5mL布氏琼脂、1.5mL脱纤维羊血和3mL10×抗微生物药溶液。9.2.1制备琼脂空白
（1）试验前或试验中，准备足够已添加维生素K，和氯化血红素的布氏琼脂，分配合适的量到试管中。每种抗微生物药的每个浓度准备一管。(2)
如果试验当天使用，分配后置于48℃-50℃水浴。如果提前制备，融化培养基（沸腾水浴，微波炉或高压锅），置于水浴（48℃-50℃）中冷却。9.2.2制备抗微生物药稀释液
融化以前制备的抗微生物药贮存液，或试验当天制备。(2）
将设计好数量（见表4）的灭菌蒸馏水加入相应管中，制备稀释液空白。(3)
使用表4所述稀释规则，1:2，1:4，和1:8连续稀释制备中间浓度（10×）抗微生物药溶液，而不是直接倍比稀释。此方法制备稀释液可使稀释错误最小化。9.2.3制备琼脂稀释平板
（1）标记制备的每一种抗微生物药的每一种浓度的平板，将平板置于水平台面上。(2)
对于制备的每一种抗微生物药浓度，将1mL脱纤维羊血（对于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物药溶液（对于方形平板3mL）加入到17mL融化并冷却的强化布氏琼脂（对于方形平板25.5mL）试管中。盖紧试管盖子，轻轻翻转数次混匀，小心不要产生气泡。倒入平板，固化。如果测试一种抗微生物药，应准备另外四个不加抗微生物药的平板，和以上（2）相同的步骤，但用灭菌蒸馏水替代抗微生物药溶液。对于另外测试的每一种抗微生物药，准备另外一个不加抗微生物药的平板琼脂固化后，可将平板盖子半开置于层流罩或温箱约30分钟使其干燥。或者是翻转平板将琼脂底盖支在盖子上。
9.2.4琼脂稀释平板的贮存
用于常规试验，试验前密封于塑料袋中于2℃-8℃贮存，不超过7天(1）
用于研究和评估目的，推荐贮存期不超过72小时。（3）
含亚胺培南，克拉维酸或其它已知不稳定的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的抗微生物药的平板必须在试验当天配制。9.3接种琼脂稀释平板
接种物接种到琼脂表面的最简便的方法是使用多点接种器取1-2uL接种到琼脂表面。那么最终琼脂上接种物每点接近10°CFU。由于大多数厌氧菌能暂时容忍暴露于氧气，所有操作可在外界环境中进行。一些苛养菌分离株则必需使用预还原平板和在厌氧环境中进行所有操作。
使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液到相同浊度，制备1）
标准化的接种物。
试管按顺序排列在架子上，将少量体积（约0.5mL）移至多点接种器的相应孔中。在琼脂平板上做标记，以标明接种点的方位。小心避免飞溅。
顺序：从最低到最高的药物浓度依次接种（5）质控：试验开始时首先接种两个无抗微生物药的对照平板。其中一个平板标记“pre-O2”（检查需氧菌污染），另外一个平板标记“pre-Ana”（厌氧菌最初生长对照）。每一系列平板之间，接种一个无抗微生物药的对照平板做生长对照。最后，再次接种两个平板，标记为“post-O2\和“post-Ana”，来证实最终病原菌生长力和纯度。9.4孵育琼脂稀释平板
（1）平板一旦变干，翻转后置于厌氧罐或替代厌氧环境中35℃孵育42-48小时。（2）有氧孵育平板（证实有氧环境中未能生长）应置于含有5%CO2环境中35℃孵育42-48小时。
9.5判读琼脂稀释终点
（1）在黑色不反光的背景下观察每一平板。首先判读对照平板，寻找需氧菌可能污染或孔间交污染。如果检测到污染，则必需重新测试。判读MIC终点是和厌氧菌对照平板相比生长特征发生显著抑制的测试平板的浓度。(2）
样本的一个显著生长变化包括薄雾状、多个细小菌落，或一个到数个正常大小菌落。10.微量肉汤稀释法
此法仅适用于测试脆弱拟杆菌菌群。10.1试剂和材料
10.1.1厌氧罐（箱）
附录所述琼脂稀释法条件同样也适用于微量肉汤稀释法。10.1.2强化布氏肉汤
布氏肉汤的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。10.2微量肉汤稀释板准备
（1）本法被称为“微量稀释”是因为使用了小体积的肉汤。这些小体积肉汤被分配到无菌塑料微量稀释板。每个小孔至少应装0.1mL肉汤。(2)
为制备（10×）抗微生物药溶液，应将浓缩的抗微生物药贮存液按表4所述内容进行稀释或进行倍比稀释。将一份10x抗微生物药溶液加入到九份肉汤中，得到所需最终浓度。
制备微量稀释板的最简便方法是使用分配装置。它可以用至少10mL肉汤制成的抗微生物药稀释液按照每孔0.1（土0.02）mL的量分配到标准的96孔中。加完各种抗微生物药稀释液的微量稀释板应使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20℃（最好<-60℃）贮存。某些药物如克拉维酸和亚胺培南，必须存在-60℃以下。应防止反复冻融
10.3微量肉汤稀释板的接种
使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液得到相同浊度，制备标准化的接种物。
（1）调整好的接种菌悬液最好在15分钟内用水或盐水稀释，接种后每管或每孔大约含1×10CFU/mL。为获得此最终接种物而采取的稀释步骤，可因接种物加到单个孔的加样方法不同而不同，因此对于每一种情况都必须进行计算。计算时必须知道微量稀释试验要加到孔内的接种物的确切体积。例如，如果孔内培养基体积是0.1mL，接种物体积为0.01mL,那么应将0.5号麦氏悬液（约1.5×10CFU/mL）按1:15稀释以获得1×10°CFU/mL的菌液。当取0.01mL此菌液接种肉汤时，细菌的最终测试浓度为1×10CFU/mL(或1×10CFU/孔）。(2)
按上述方法对接种物进行标准化后15分钟内，可以用接种装置取体积不超过小孔体积10%的接种物（如在0.1mL抗微生物药液中接种物应≤10叫L）接种微量稀释板的每个孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的内容物将被1:2稀释。（3）为菌落计数，实验室应经常用脆弱拟杆菌ATCC25285练习，以保证技术熟练10.4微量肉汤稀释板孵育
为保证孵育温度，微量稀释板的叠放不应超过四层。(1）
（2）
接种好的微量稀释板应放在厌氧环境中35℃孵育46-48小时。(3)
应采取措施防止微量稀释板的蒸发。10.5判读微量肉汤稀释终点
在黑色，使用间接光无反射光的背景下观察，放大镜可使用。(2)
如果生长对照孔的生长微弱或不生长，则不应判读。MIC终点应是观察到的无细菌生长或最显著抑制细菌生长的抗微生物药浓度。一些药物/病原菌组合可观察到拖尾效应11.β-内酰胺酶试验
在敏感试验之前，可使用产色头孢菌素为基础的方法进行除脆弱拟杆菌菌群外厌氧菌β-内酰胺酶活性检测。大多数脆弱拟杆菌菌群分离株产生β-内酰胺酶，认为对青霉素耐药，因此不需要常规β-内酰胺酶检测。12.质量控制的方法
12.1目的
质控工作的目的是监测敏感试验步骤的精密度和准确度，试剂和设备的质量，和进行试验的工作人员的操作。为达到上述目的，最好选用遗传性稳定和在特定方法中有用的标准参考菌株。可向国家药品及食品监督管理局检定所菌种库购买。12.2批次的质控
对于琼脂稀释，每一批新的培养基、试剂、补充剂或抗微生物药首次使用时应进行所有三种质控菌株的质控试验。对于自制的微量肉汤稀释板，每一批至少取一个微量稀释板孵育过夜以保证培养基的无菌性（剩余稀释板可冷冻贮存于-20℃，最好是-60℃）。对于商业制备的平板，应依据厂商说明进行质控。12.3质控菌株和质控频率
有三种质控菌株常用于质控。厌氧菌敏感试验时，琼脂稀释推荐使用以下至少两种质控菌株来监测试验步骤。微量肉汤稀释和临床分离株的常规试验则推荐使用一种或一种以上质控菌株。应使用列于表5和表6中的限制对试验系统的整体表现进行监控。脆弱拟杆菌ATCC25285
多型拟杆菌ATCC29741
迟缓优杆菌ATCC43055
12.4纠正措施
当质控超过特定范围而且结果失控，应寻找原因（如使用了错误的质控菌株，菌株明显的污染，或使用了错误的孵育条件或温度等），并做出失控报告，重新操作直至在控，经科负责人批准再实施临床检测。
12.5其他对照步骤
12.5.1生长对照
每一种琼脂稀释平板和微量肉汤稀释板都应包含一个不含抗微生物药的基础培养基做生长对照，以评价受试菌的活力。对于肉汤试验，生长对照亦可作为判读终点时的浊度对照。12.5.2纯度对照
琼脂或肉汤稀释试验接种时，从每一种接种物中取样在强化布氏琼脂平板上划线，厌氧和需氧孵育过夜以检测混合培养物，同时如果需要重复试验，它可以提供新鲜的单个菌落。这一步骤对于肉汤稀释法特别重要，因为在肉汤稀释法中，混合培养物有可能未被察觉。12.5.3接种物对照
定期抽取代表性接种物进行平板计数以保证0.5号麦氏标准、标准化的接种步骤和接种物的稀释在允许范围内。用于平板计数的样品应在接种后立即取自微量稀释板的生长对照孔或者是多点接种器的一个随机保存孔。12.5.4终点稀释对照
定期对终点解释进行监测可以减少不同观察者之间对终点解释的差异。所有进行本试验的实验室人员都应独立判读一套选定的稀释试验。将记录的结果同某个有经验判读者的结果进行比较。所有判读者相互之间的差异不能超过土1倍比浓度变化。附录：培养基和补充剂的制备
1补充剂
1.1氯化血红素贮存液（5mg/mL）(1）将0.1g氯化血红素溶解于2mL1.0N的NaOH中。(2）加入蒸馏水至20mL,121℃灭菌15分钟。(3）避光贮存于4-8℃不超过一个月。1.2氢氧化钠（1.ON）
（1）将40g氢氧化钠于溶解于1L的蒸馏水中。(2）室温贮存于密封容器不超过六个月。1.3维生素Ki溶液
1.3.1存液（10mg/mL）
（1）将0.2mL维生素K加到20mL95%乙醇中。(2）4-8℃贮存于黑色瓶中不超过一年。1.3.2工作液（1mg/mL）
(1）将1mL贮存液加到9mL的灭菌蒸馏水中。(2）4-8℃贮存于黑色瓶中不超过一个月。1.4碳酸氢钠贮存液（20mgmL）
(1）将2gNaHCO3溶解于100mL的蒸馏水中。(2）滤过灭菌（孔径0.2μm）。(3）使用当天制备。
1.5脱纤维羊血
-20℃或更低温度冷冻脱纤维羊血。融化羊血。可允许方法包括35-37℃水浴中快速融化或2-8℃缓慢融化过夜。使用前翻转容器数次充分混匀。加入到融化布氏琼脂前48-50℃水浴加热。1.6马冻融血（LHB，50%）
无菌混匀等量脱纤维马血和灭菌蒸馏水（50%）。将50%马血冷冻（≤-20℃）和融化五5-7次，直到细胞完全溶解。12，000×g离心20分钟
弃去表层物，检查清晰度（不含影响判读MIC终点的沉淀物）。用于微量肉汤稀释试验，肉汤和LHB必须清晰。必要时离心。注意：用于微量肉汤稀释法的马冻融血有商业来源。2培养基
2.1强化布氏琼脂bZxz.net
（1）按下列配方配制布氏琼脂粉末(2)
胰消化酪蛋白10g
动物组织多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化钠5g
亚硫酸钠0.1g
琼脂15g
1,000mL蒸馏水中加入：
布氏琼脂粉末43g
氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
煮沸溶解琼脂。121℃高压灭菌15分钟。培养基冷却至48-50℃。
加入50mL灭菌脱纤维羊血
注意：不加入脱纤维羊血的培养基可以在试管或瓶子小体积分装冷冻。试验时溶解培养基，冷却至48-50℃。每100mL培养基加入5mL灭菌脱纤维羊血。2.2强化布氏肉汤
按下列配方配制布氏肉汤粉末
胰消化酪蛋白10g
动物组织多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化钠5g
亚硫酸钠0.1g
1000mL蒸馏水中加入：
布氏肉汤粉末28g
氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
（3）煮沸溶解。121℃C高压灭菌15分钟。（4）肉汤冷却至4℃，加入100mL灭菌马冻融血（50%）。（5）4-8℃购存。
2.3硫代硫酸盐营养肉汤
1,000mL蒸馏水中加入
不含指示剂的硫代硫酸盐培养基30g氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
煮沸溶解琼脂（硫代硫酸盐肉汤含有少量琼脂）。每管5mL分装至试管中。121℃高压灭菌15分钟。
避光贮存于常温不超过六个月。使用时煮沸五分钟；冷却。每管加入0.25mL滤过灭菌的碳酸氢钠贮存液。做为加入碳酸氢钠替代品，高压灭菌前每管可加入大理石碎片。2.4麦氏浊度标准（0.5号）
将0.5mL0.048mol/L的BaCL2（1.175%w/vBaCL22H2O)加到99.5mL0.18mol/L（0.36N）的H2SO4(1%v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。(2)
按每管4-6mL将硫酸钡悬液分装于带悬盖的管子中，管子尺寸应与培养或稀释接种菌所用的管子一致。
这些管子应密封并贮存于室温避光处。每次使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。使用前核实其正确浓度，每个月都应证实或更换。浊度标准的正确浓度应使用分光光度计测定吸光度核实。该分光光度计光径为1cm，并配有合适的比色杯。0.5号麦氏标准管在625nm处的吸光度值应为0.08-0.10。注意：商业上可得到乳胶颗粒悬液制成的麦氏分光光度计标准。使用时轻轻反转混匀（而不是在旋转混匀器上）。
表1:厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组除脆弱拟杆菌菌群外
脆弱拟杆菌菌群
氨苄西林/舒巴坦
或阿莫西林/克拉
拉西林/三唑巴
坦或替卡西林/克
拉维酸（分离株对
氨苄西林/舒巴坦
和/或阿莫西林/
克拉维酸耐药时）
头孢西丁
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
氯霉素
哌拉西林
曲发沙星
革兰氏阴性厌氧菌
β-内酰胺酶b.e
阳性菌株
氨苄西林/舒巴
坦或阿莫西林
克拉维酸
哌拉西林/三唑
巴坦或替卡西
林/克拉维酸
（对氨芙西林）
舒巴坦或阿莫
西林/克拉维酸
耐药时）
头孢西丁或
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
氯霉素
四环素
曲发沙星
β-内酰胺酶b
阴性菌株
氨芙西林或
青霉素“
克林霉素
甲硝唑
头孢替坦或
头孢西丁或
头孢唑
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
曲发沙星
除产气荚膜
梭菌外梭菌
属菌种
青霉素或
氨苄西林。
阿莫西林/克
拉维酸或氨
芋西林/舒巴
哌拉西林/三
唑巴坦或替
卡西林/克拉
头孢西丁或
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
产气荚膜梭菌
消化球菌属
无芽孢革兰氏
阳性菌
氨苄西林或
青霉素。
克林霉素
甲硝唑
头孢替坦或
头孢唑或
头孢西丁
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
包括拟杆菌属其它菌种，普雷沃氏菌属，卧啉单胞菌属，梭杆菌属，韦荣氏球菌属，萨a.
顿氏菌属，嗜胆菌属。
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WS/T248-2005
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法Methods for Antimicrobial SusceptibilityTesting of Anaerobic Bacteria2005-5-16发布
2005-12-1实施
2．引用标准
3．定义
中华人民共和国卫生部
进行厌氧菌敏感试验的指征
厌氧菌敏感试验的局限性
抗微生物药
常规试验和报告中抗微生物药的选择7.
稀释试验接种物制备
9参考琼脂稀释法（Wadsworth法）10.微量肉汤稀释法
11.β-内酰胺酶试验
12、质量控制的方法
附录：培养基和补充剂的制备
表1：厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组表2：解释标准和相对应最低抑菌浓度（MIC）值表3：制备抗微生物药贮存液需要的溶剂和稀释液发布
表4：琼脂稀释法或微量肉汤稀释法敏感试验中抗微生物药稀释液的制备方案表5：参比琼脂稀释试验标质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围表6：微量肉汤稀释试验质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围前言
临床细菌分离中由于庆厌氧菌感染日渐增多，厌氧菌的药敏试验和耐药监测已提到日程上。本标准是在卫生部颁发的《全国临床检验操作规程》（第三版）的基础上，依据美国国家临床实验室标准化委员会（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards,NCCLS）M11-A5文件一厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法（已批准的标准一第五版）[ISBN1-56238-429-5]，结合中国国情及卫生系统的实际情况和要求制定。本标准从2004年月
日起实施。
本标准由卫生部提出。
本标准起草单位：北京大学人民医院检验科。本标准主要起草人：张正岳志红。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。中华人民共和国卫生行业标准
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法MethodsforAntimicrobial SusceptibilityTestingofAnaerobicBacteria
WS/T248-2005
本文件所述方法主要用于测试普通分离到的厌氧菌。琼脂稀释法可用于测试大多数厌氧病原菌。目前微量肉汤稀释法仅用于测试脆弱拟杆菌菌群的病原菌。本标准适用于从事厌氧菌抗微生物药敏感试验的临床实验室使用。2.
引用标准
下列标准条文主要根据美国NCCLS的MII-A5文件和中华人民共和国卫生部医政司编制的《全国临床检验操作规程》（第三版）而制定。3．定义
3.1琼脂稀释敏感试验
将某一种抗微生物药的系列浓度混入用于敏感试验的琼脂生长培养基进行的抗微生物药敏感试验。
3.2敏感
指该菌株所致感染可以用推荐用于此型感染及病原菌的抗微生物药剂量进行恰当地治疗。
3.3中介
药物在生理浓集的部位具有临床效力或者可用高于正常剂量的药物进行治疗：此还包括一个“缓冲区”可以防止微小的，未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。3.4耐药
指常规剂量抗微生物药通常达到的浓度不能抑制该菌株的生长和/或该菌株的MIC落于某范围内。在此范围内，可存在某些特定的耐药机制（如β-内酰胺酶类），并且治疗研究显示其临床疗效并不可靠。
3.5最小抑菌浓度
琼脂或肉汤稀释敏感试验中抗微生物药抑制某一种微生物可见生长的最低浓度。4.进行厌氧菌敏感试验的指征
临床上有厌氧菌感染存在，并在实验室分离出厌氧菌，原则上均应进行抗微生物药敏感试验。
4.1常规试验
从脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、人工装置或人工血管感染和菌血症分离到的特殊感染的标本应该测试，并应参考临床医生的合理建议。当感染的性质不清楚，标本含有内源性厌氧菌菌群，而且病原菌与正在治疗的感染关系很少时，通常不必做敏感试验。当存在多种厌氧菌时，参考临床情况选择可能引起厌氧菌感染的最重要菌种进行敏感试验。一股分离到拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属。梭菌属、嗜胆菌属和萨顿氏菌属的一些菌种应做敏感试验。敏感试验应使用分纯后菌悬液。不能直接用临床标本进行敏感试验。MIC试验一般采用倍比稀释，采用本标准推荐方法，做好质控，结果报告采用在实际终点时的一个倍比稀释范围内较为科学。例如：终点为16ug/mL，真正报告应8ug/ml-32ug/ml范围更好。并做出敏感、中介或耐药判断，以供临床参考。4.2监测试验
当技术条件不允许每个实验室都进行厌氧菌敏感试验时，建议当地建立参考实验室，收集一定量临床菌株（不少于50-100株），集中测试后公布结果供大家参考。5.厌氧菌敏感试验的局限性
体外结果不足以预测某个病人对厌氧菌感染治疗的反应，仅供临床选药参考。此标准的试验方法也并不一定适用于所有的厌氧菌，以下2点需考虑。5.1折点和临床相关
关于确定厌氧菌对大多数抗微生物药的敏感性的折点，现在并无一致意见。目前折点的确定是基于动物模型或需氧和厌氧菌多重感染的病人的临床试验结果。因为大多数厌氧菌感染发生于密闭空间，涉及多种微生物，单一抗微生物药抗单一微生物的体外活性并不直接与其体内效力相关。
除数目分布和临床效力之外，MIC结果的敏感和中介折点解释是基于最大的推荐剂量获得的血清水平，因为厌氧菌感染通常推荐最大剂量用药。建立中介范围是因为有些药物难于判读终点和MIC在折点附近聚集。5.2病原菌
琼脂稀释法适用于测试多种不同的厌氧菌。至今为止，微量肉汤稀释法仅限于测试脆弱拟杆菌菌群。当测试菌呈蔓延生长时（例如艰难梭菌或破伤风梭菌），则需要尽量在琼脂平板上划开接种物。而对于败毒梭菌，每个平板只能测试一个分离株。6.抗微生物药
6.1来源
抗微生物药标准品或参考药品可直接来自厂商，或来自中国药品及食品监督管理局检定所，或其他商业途径。不应把非肠道的制品用于敏感试验。可接受的药品应贴有标签，标明药品的通用名，批号，分析活力（常用每mg药品中含ug或国际单位（IU）表示）和有效期。贮存于规定的温度和湿度中。用时防止冷凝水进入。6.2抗微生物药的称量
实验室必须根据该批待用药品的分析结果来标化其抗微生物药溶液。抗微生物药品应使用经计量认证的分析天平称量。公式如下：重量(mg)-体积（mL）×所需浓度（μg/mL）分析活力（μg/mg）
体积（mL）=重量（mg）X分析活力（ug/mg）所需浓度（μg/mL）
6.3制备贮存液
抗微生物药贮存液制备的浓度一般应该至少为1,000μg/mL(如1,280μg/mL)或者是最高测试浓度的10倍。某些药物必须溶解于非水溶剂中。此时，应使用尽量少的溶剂来溶解抗微生物药。最终的贮存液可用水或表3所述的合适的稀释剂进行稀释。贮存液分装后贮存于规定温度下，一般-60℃可保存半年。6.4测试浓度的数目
一种特定抗微生物药的测试浓度应包含表2所示的解释性折点，但实测的浓度数目是由实验室决定的。MIC结果报告推荐选用五个或更多浓度。建议选用的范围应包涵质控菌株的在控数值。
7.常规试验和报告中抗微生物药的选择敏感试验抗微生物药品种类选择可参考表1。在实际应用中，应结合我国实情，参考实验室所在的临床单位医生及控感科意见做出合适选择，不断积累经验。完整的报告单应包括患者一般资料（姓名、性别、年龄和病理号等）。药品名称应按照我国药典颁布名称。菌种名称按照卫生部已公布名词标准。应报告敏感、中介和耐药。8.稀释试验接种物制备
受试菌应是从强化布氏血琼脂选择经充足时间孵育（24-48小时）产生的合适大小的菌落。菌落直径通常至少1毫米。快速生长菌如脆弱拟杆菌菌群和产气荚膜梭菌可经24小时孵育后测试，而其它大多数厌氧菌需要48小时孵育。对于缓慢生长的厌氧菌，如嗜胆菌属和纤细弯曲杆菌，可以从多个琼脂平板制备接种物以保证标准化的准确。可通过生长法或直接菌落悬液法制备接种物。
8.1制备接种物时的浊度标准
为使敏感试验的接种浓度标准化，应使用一个等同于0.5号麦氏（McFarland）标准管的BaSO4浊度标准管或其光学等同物（如乳胶颗粒悬液）。BaSO4的0.5号麦氏标准管制备见附录。
8.2分离株的贮存和复苏
8.2.1冷冻
大多数厌氧菌可在20%甘油中在-60℃或更低温度保存数年。将四份48小时肉汤培养物转移到含有一份无菌甘油的无菌玻璃瓶中。充分混匀成均一悬液后冷冻。预还原时使用不加糖的疱肉培养基。
另外，也可将48小时平板培养的若干菌落直接悬浮于20%灭菌脱脂牛奶中，-60℃冷冻。8.2.2复苏
冻存的分离株必须在强化布氏血琼脂上至少传代两次，用于敏感试验前必须证明其纯度。
8.3生长法
（1）从强化布氏血琼脂选择经24小时或充足时间孵育产生的合适大小的菌落（直径至少1毫米）。挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，或用3mm直径的接种环取满一环，接种于无指示剂的硫代硫酸盐培养基。如果此步骤使用厌氧箱，可使用强化布氏肉汤，强化脑心浸液或Schaedler氏肉汤替代硫代硫酸盐肉汤。(2)
孵育肉汤6-24小时或直至获得足够浊度。加入布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，调整浊度等于0.5号麦氏标准。对于大肠杆菌ATCC25922或脆弱拟杆菌ATCC25285，此时悬液中细菌数约为1-2×10~CFU/mL。但应注意到不同厌氧菌分离株接种大小的变化。8.4直接菌落悬液法
此法是从孵育了24-48小时强化布氏血琼脂平板挑取菌落。制备悬液时平板在有氧(1）
环境中不应超过30分钟。
轻轻挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，直接转移到布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，获得相当于0.5麦氏标准的浊度。此法制备厌氧菌的一些菌种菌悬液计数会轻度升高。(3）
9．参考琼脂稀释法（Wadsworth法）9.1试剂和材料
9.1.1厌氧罐（箱）
采用环境含4-7%CO2厌氧罐（箱），并应有无氧状态指示剂。9.1.2强化布氏琼脂
使用的培养基是每mL布氏琼脂中添加5μg氯化血红素、1μg维生素K,和5%脱纤维羊血(v/v)。布氏琼脂的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。也可提前配制琼脂，使用当天融化。制备抗微生物药稀释液后，抗微生物药和脱纤维羊血一起加入到融化琼脂中。9.2琼脂稀释平板的制备步骤
开始前，确定抗微生物药及其所用浓度。制备琼脂稀释平板时，15×100圆形平板需要20mL琼脂，方形平板需要30mL。平板的制备是将一份10×抗微生物药溶液加入到九份琼脂中。例如：制备20mL琼脂的圆形平板，需要在17mL已添加氯化血红素和维生素K,的融化的布氏琼脂（保持在45℃-50℃）中加入1mL脱纤维羊血和2mL10x抗微生物药溶液。方形平板则是25.5mL布氏琼脂、1.5mL脱纤维羊血和3mL10×抗微生物药溶液。9.2.1制备琼脂空白
（1）试验前或试验中，准备足够已添加维生素K，和氯化血红素的布氏琼脂，分配合适的量到试管中。每种抗微生物药的每个浓度准备一管。(2)
如果试验当天使用，分配后置于48℃-50℃水浴。如果提前制备，融化培养基（沸腾水浴，微波炉或高压锅），置于水浴（48℃-50℃）中冷却。9.2.2制备抗微生物药稀释液
融化以前制备的抗微生物药贮存液，或试验当天制备。(2）
将设计好数量（见表4）的灭菌蒸馏水加入相应管中，制备稀释液空白。(3)
使用表4所述稀释规则，1:2，1:4，和1:8连续稀释制备中间浓度（10×）抗微生物药溶液，而不是直接倍比稀释。此方法制备稀释液可使稀释错误最小化。9.2.3制备琼脂稀释平板
（1）标记制备的每一种抗微生物药的每一种浓度的平板，将平板置于水平台面上。(2)
对于制备的每一种抗微生物药浓度，将1mL脱纤维羊血（对于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物药溶液（对于方形平板3mL）加入到17mL融化并冷却的强化布氏琼脂（对于方形平板25.5mL）试管中。盖紧试管盖子，轻轻翻转数次混匀，小心不要产生气泡。倒入平板，固化。如果测试一种抗微生物药，应准备另外四个不加抗微生物药的平板，和以上（2）相同的步骤，但用灭菌蒸馏水替代抗微生物药溶液。对于另外测试的每一种抗微生物药，准备另外一个不加抗微生物药的平板琼脂固化后，可将平板盖子半开置于层流罩或温箱约30分钟使其干燥。或者是翻转平板将琼脂底盖支在盖子上。
9.2.4琼脂稀释平板的贮存
用于常规试验，试验前密封于塑料袋中于2℃-8℃贮存，不超过7天(1）
用于研究和评估目的，推荐贮存期不超过72小时。（3）
含亚胺培南，克拉维酸或其它已知不稳定的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的抗微生物药的平板必须在试验当天配制。9.3接种琼脂稀释平板
接种物接种到琼脂表面的最简便的方法是使用多点接种器取1-2uL接种到琼脂表面。那么最终琼脂上接种物每点接近10°CFU。由于大多数厌氧菌能暂时容忍暴露于氧气，所有操作可在外界环境中进行。一些苛养菌分离株则必需使用预还原平板和在厌氧环境中进行所有操作。
使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液到相同浊度，制备1）
标准化的接种物。
试管按顺序排列在架子上，将少量体积（约0.5mL）移至多点接种器的相应孔中。在琼脂平板上做标记，以标明接种点的方位。小心避免飞溅。
顺序：从最低到最高的药物浓度依次接种（5）质控：试验开始时首先接种两个无抗微生物药的对照平板。其中一个平板标记“pre-O2”（检查需氧菌污染），另外一个平板标记“pre-Ana”（厌氧菌最初生长对照）。每一系列平板之间，接种一个无抗微生物药的对照平板做生长对照。最后，再次接种两个平板，标记为“post-O2\和“post-Ana”，来证实最终病原菌生长力和纯度。9.4孵育琼脂稀释平板
（1）平板一旦变干，翻转后置于厌氧罐或替代厌氧环境中35℃孵育42-48小时。（2）有氧孵育平板（证实有氧环境中未能生长）应置于含有5%CO2环境中35℃孵育42-48小时。
9.5判读琼脂稀释终点
（1）在黑色不反光的背景下观察每一平板。首先判读对照平板，寻找需氧菌可能污染或孔间交污染。如果检测到污染，则必需重新测试。判读MIC终点是和厌氧菌对照平板相比生长特征发生显著抑制的测试平板的浓度。(2）
样本的一个显著生长变化包括薄雾状、多个细小菌落，或一个到数个正常大小菌落。10.微量肉汤稀释法
此法仅适用于测试脆弱拟杆菌菌群。10.1试剂和材料
10.1.1厌氧罐（箱）
附录所述琼脂稀释法条件同样也适用于微量肉汤稀释法。10.1.2强化布氏肉汤
布氏肉汤的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。10.2微量肉汤稀释板准备
（1）本法被称为“微量稀释”是因为使用了小体积的肉汤。这些小体积肉汤被分配到无菌塑料微量稀释板。每个小孔至少应装0.1mL肉汤。(2)
为制备（10×）抗微生物药溶液，应将浓缩的抗微生物药贮存液按表4所述内容进行稀释或进行倍比稀释。将一份10x抗微生物药溶液加入到九份肉汤中，得到所需最终浓度。
制备微量稀释板的最简便方法是使用分配装置。它可以用至少10mL肉汤制成的抗微生物药稀释液按照每孔0.1（土0.02）mL的量分配到标准的96孔中。加完各种抗微生物药稀释液的微量稀释板应使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20℃（最好<-60℃）贮存。某些药物如克拉维酸和亚胺培南，必须存在-60℃以下。应防止反复冻融
10.3微量肉汤稀释板的接种
使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液得到相同浊度，制备标准化的接种物。
（1）调整好的接种菌悬液最好在15分钟内用水或盐水稀释，接种后每管或每孔大约含1×10CFU/mL。为获得此最终接种物而采取的稀释步骤，可因接种物加到单个孔的加样方法不同而不同，因此对于每一种情况都必须进行计算。计算时必须知道微量稀释试验要加到孔内的接种物的确切体积。例如，如果孔内培养基体积是0.1mL，接种物体积为0.01mL,那么应将0.5号麦氏悬液（约1.5×10CFU/mL）按1:15稀释以获得1×10°CFU/mL的菌液。当取0.01mL此菌液接种肉汤时，细菌的最终测试浓度为1×10CFU/mL(或1×10CFU/孔）。(2)
按上述方法对接种物进行标准化后15分钟内，可以用接种装置取体积不超过小孔体积10%的接种物（如在0.1mL抗微生物药液中接种物应≤10叫L）接种微量稀释板的每个孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的内容物将被1:2稀释。（3）为菌落计数，实验室应经常用脆弱拟杆菌ATCC25285练习，以保证技术熟练10.4微量肉汤稀释板孵育
为保证孵育温度，微量稀释板的叠放不应超过四层。(1）
（2）
接种好的微量稀释板应放在厌氧环境中35℃孵育46-48小时。(3)
应采取措施防止微量稀释板的蒸发。10.5判读微量肉汤稀释终点
在黑色，使用间接光无反射光的背景下观察，放大镜可使用。(2)
如果生长对照孔的生长微弱或不生长，则不应判读。MIC终点应是观察到的无细菌生长或最显著抑制细菌生长的抗微生物药浓度。一些药物/病原菌组合可观察到拖尾效应11.β-内酰胺酶试验
在敏感试验之前，可使用产色头孢菌素为基础的方法进行除脆弱拟杆菌菌群外厌氧菌β-内酰胺酶活性检测。大多数脆弱拟杆菌菌群分离株产生β-内酰胺酶，认为对青霉素耐药，因此不需要常规β-内酰胺酶检测。12.质量控制的方法
12.1目的
质控工作的目的是监测敏感试验步骤的精密度和准确度，试剂和设备的质量，和进行试验的工作人员的操作。为达到上述目的，最好选用遗传性稳定和在特定方法中有用的标准参考菌株。可向国家药品及食品监督管理局检定所菌种库购买。12.2批次的质控
对于琼脂稀释，每一批新的培养基、试剂、补充剂或抗微生物药首次使用时应进行所有三种质控菌株的质控试验。对于自制的微量肉汤稀释板，每一批至少取一个微量稀释板孵育过夜以保证培养基的无菌性（剩余稀释板可冷冻贮存于-20℃，最好是-60℃）。对于商业制备的平板，应依据厂商说明进行质控。12.3质控菌株和质控频率
有三种质控菌株常用于质控。厌氧菌敏感试验时，琼脂稀释推荐使用以下至少两种质控菌株来监测试验步骤。微量肉汤稀释和临床分离株的常规试验则推荐使用一种或一种以上质控菌株。应使用列于表5和表6中的限制对试验系统的整体表现进行监控。脆弱拟杆菌ATCC25285
多型拟杆菌ATCC29741
迟缓优杆菌ATCC43055
12.4纠正措施
当质控超过特定范围而且结果失控，应寻找原因（如使用了错误的质控菌株，菌株明显的污染，或使用了错误的孵育条件或温度等），并做出失控报告，重新操作直至在控，经科负责人批准再实施临床检测。
12.5其他对照步骤
12.5.1生长对照
每一种琼脂稀释平板和微量肉汤稀释板都应包含一个不含抗微生物药的基础培养基做生长对照，以评价受试菌的活力。对于肉汤试验，生长对照亦可作为判读终点时的浊度对照。12.5.2纯度对照
琼脂或肉汤稀释试验接种时，从每一种接种物中取样在强化布氏琼脂平板上划线，厌氧和需氧孵育过夜以检测混合培养物，同时如果需要重复试验，它可以提供新鲜的单个菌落。这一步骤对于肉汤稀释法特别重要，因为在肉汤稀释法中，混合培养物有可能未被察觉。12.5.3接种物对照
定期抽取代表性接种物进行平板计数以保证0.5号麦氏标准、标准化的接种步骤和接种物的稀释在允许范围内。用于平板计数的样品应在接种后立即取自微量稀释板的生长对照孔或者是多点接种器的一个随机保存孔。12.5.4终点稀释对照
定期对终点解释进行监测可以减少不同观察者之间对终点解释的差异。所有进行本试验的实验室人员都应独立判读一套选定的稀释试验。将记录的结果同某个有经验判读者的结果进行比较。所有判读者相互之间的差异不能超过土1倍比浓度变化。附录：培养基和补充剂的制备
1补充剂
1.1氯化血红素贮存液（5mg/mL）(1）将0.1g氯化血红素溶解于2mL1.0N的NaOH中。(2）加入蒸馏水至20mL,121℃灭菌15分钟。(3）避光贮存于4-8℃不超过一个月。1.2氢氧化钠（1.ON）
（1）将40g氢氧化钠于溶解于1L的蒸馏水中。(2）室温贮存于密封容器不超过六个月。1.3维生素Ki溶液
1.3.1存液（10mg/mL）
（1）将0.2mL维生素K加到20mL95%乙醇中。(2）4-8℃贮存于黑色瓶中不超过一年。1.3.2工作液（1mg/mL）
(1）将1mL贮存液加到9mL的灭菌蒸馏水中。(2）4-8℃贮存于黑色瓶中不超过一个月。1.4碳酸氢钠贮存液（20mgmL）
(1）将2gNaHCO3溶解于100mL的蒸馏水中。(2）滤过灭菌（孔径0.2μm）。(3）使用当天制备。
1.5脱纤维羊血
-20℃或更低温度冷冻脱纤维羊血。融化羊血。可允许方法包括35-37℃水浴中快速融化或2-8℃缓慢融化过夜。使用前翻转容器数次充分混匀。加入到融化布氏琼脂前48-50℃水浴加热。1.6马冻融血（LHB，50%）
无菌混匀等量脱纤维马血和灭菌蒸馏水（50%）。将50%马血冷冻（≤-20℃）和融化五5-7次，直到细胞完全溶解。12，000×g离心20分钟
弃去表层物，检查清晰度（不含影响判读MIC终点的沉淀物）。用于微量肉汤稀释试验，肉汤和LHB必须清晰。必要时离心。注意：用于微量肉汤稀释法的马冻融血有商业来源。2培养基
2.1强化布氏琼脂bZxz.net
（1）按下列配方配制布氏琼脂粉末(2)
胰消化酪蛋白10g
动物组织多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化钠5g
亚硫酸钠0.1g
琼脂15g
1,000mL蒸馏水中加入：
布氏琼脂粉末43g
氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
煮沸溶解琼脂。121℃高压灭菌15分钟。培养基冷却至48-50℃。
加入50mL灭菌脱纤维羊血
注意：不加入脱纤维羊血的培养基可以在试管或瓶子小体积分装冷冻。试验时溶解培养基，冷却至48-50℃。每100mL培养基加入5mL灭菌脱纤维羊血。2.2强化布氏肉汤
按下列配方配制布氏肉汤粉末
胰消化酪蛋白10g
动物组织多肽消化物10g
右旋糖1g
酵母提取物2g
氯化钠5g
亚硫酸钠0.1g
1000mL蒸馏水中加入：
布氏肉汤粉末28g
氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
（3）煮沸溶解。121℃C高压灭菌15分钟。（4）肉汤冷却至4℃，加入100mL灭菌马冻融血（50%）。（5）4-8℃购存。
2.3硫代硫酸盐营养肉汤
1,000mL蒸馏水中加入
不含指示剂的硫代硫酸盐培养基30g氯化血红素贮存液1mL
维生素K,工作液1mL
煮沸溶解琼脂（硫代硫酸盐肉汤含有少量琼脂）。每管5mL分装至试管中。121℃高压灭菌15分钟。
避光贮存于常温不超过六个月。使用时煮沸五分钟；冷却。每管加入0.25mL滤过灭菌的碳酸氢钠贮存液。做为加入碳酸氢钠替代品，高压灭菌前每管可加入大理石碎片。2.4麦氏浊度标准（0.5号）
将0.5mL0.048mol/L的BaCL2（1.175%w/vBaCL22H2O)加到99.5mL0.18mol/L（0.36N）的H2SO4(1%v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。(2)
按每管4-6mL将硫酸钡悬液分装于带悬盖的管子中，管子尺寸应与培养或稀释接种菌所用的管子一致。
这些管子应密封并贮存于室温避光处。每次使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。使用前核实其正确浓度，每个月都应证实或更换。浊度标准的正确浓度应使用分光光度计测定吸光度核实。该分光光度计光径为1cm，并配有合适的比色杯。0.5号麦氏标准管在625nm处的吸光度值应为0.08-0.10。注意：商业上可得到乳胶颗粒悬液制成的麦氏分光光度计标准。使用时轻轻反转混匀（而不是在旋转混匀器上）。
表1:厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组除脆弱拟杆菌菌群外
脆弱拟杆菌菌群
氨苄西林/舒巴坦
或阿莫西林/克拉
拉西林/三唑巴
坦或替卡西林/克
拉维酸（分离株对
氨苄西林/舒巴坦
和/或阿莫西林/
克拉维酸耐药时）
头孢西丁
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
氯霉素
哌拉西林
曲发沙星
革兰氏阴性厌氧菌
β-内酰胺酶b.e
阳性菌株
氨苄西林/舒巴
坦或阿莫西林
克拉维酸
哌拉西林/三唑
巴坦或替卡西
林/克拉维酸
（对氨芙西林）
舒巴坦或阿莫
西林/克拉维酸
耐药时）
头孢西丁或
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
氯霉素
四环素
曲发沙星
β-内酰胺酶b
阴性菌株
氨芙西林或
青霉素“
克林霉素
甲硝唑
头孢替坦或
头孢西丁或
头孢唑
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
曲发沙星
除产气荚膜
梭菌外梭菌
属菌种
青霉素或
氨苄西林。
阿莫西林/克
拉维酸或氨
芋西林/舒巴
哌拉西林/三
唑巴坦或替
卡西林/克拉
头孢西丁或
头孢替坦
克林霉素
亚胺培南或
美罗培南
甲硝唑
头孢唑
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
产气荚膜梭菌
消化球菌属
无芽孢革兰氏
阳性菌
氨苄西林或
青霉素。
克林霉素
甲硝唑
头孢替坦或
头孢唑或
头孢西丁
头孢曲松
哌拉西林或
替卡西林或
美洛西林
包括拟杆菌属其它菌种，普雷沃氏菌属，卧啉单胞菌属，梭杆菌属，韦荣氏球菌属，萨a.
顿氏菌属，嗜胆菌属。
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