本标准规定了牛奶和奶粉中呋喃它酮代谢物（5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮，英文缩写为ＡＭＯＺ）、呋喃西林代谢物（氨基脲，英文缩写为ＳＥＭ）、呋喃妥因代谢物和呋喃唑酮代谢物留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中ＡＭＯＺ、ＳＥＭ、ＡＨＤ 和ＡＯＺ残留量的测定。 GB/T 22987-2008 牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22987-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22987-—2008
牛奶和奶粉中喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物
残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determinationfortheresidues of furaltadon,nitrofurazonenitrofurantoin and furazolidone metabolites in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张进杰、曹亚平、刘晓茂、曹彦忠、王静淑、杨志伟、庞国芳GB/T22987—2008
1范围
牛奶和奶粉中喃它酮、喃西林、喃要因和呋喃唑酮代谢物
残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22987—2008
本标准规定了牛奶和奶粉中呋喃它酮代谢物（5-吗啉甲基-3-氨基-2-喽唑烷基酮，英文缩写为AMOZ)、哺西林代谢物（氨基脲，英文缩写为SEM）、呋喃妥因代谢物（1-氨基-2-内酰脲，英文缩写为AHD)和呋哺唑酮代谢物（3-氨基-2-嗯唑烷基酮，英文缩写为AOZ)残留量液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于牛奶和奶粉中AMOZ、SEM、AHD和AOZ残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为0.2μg/kg；奶粉中AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为1.6μg/kg。注：本标准中呋喃它酮、嘴西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物中英名称及英文缩写参见附录A中的表A,1。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
牛奶或奶粉试样用三氯乙酸水解并脱蛋白，硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，用OasisHLB或性能相当的固相萃取柱净化。液相色谱-串联质谱仪（ESI+）检测。用内标法或外标法定量。
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯。4.1水GB/T6682，-级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙睛：色谱纯。
4.4乙酸乙酯：色谱纯。
4.5磷酸氢二钾，K2HPO4。
4.6乙酸。
4.7二甲亚砜。
GB/T22987-—2008
4.8盐酸。
4.9三氯乙酸，CHCl,O2。
4.10氢氧化钠。
4.112-硝基苯甲醛（2-NP),C,H,NO：含量≥99%。4.120.1mol/L磷酸氢二钾溶液：称取17.4g磷酸氢二钾（4.5）,用水溶解，定容至1000mL4.130.2mol/L盐酸：量取17mL浓盐酸（4.8）,用水定容至1000mL。4.144mol/L氢氧化钠溶液：称取80g氢氧化钠（4.10），用水溶解，定容至500mL。4.150.5mol/L三氯乙酸溶液：称取37.5g三氯乙酸（4.9），用水溶解，定容至500mL4.16衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05mol/L。称取0.075g2-硝基苯甲醛（4.11)溶于10mL二甲亚砜（4.7)，现用现配。
4.17样品定容溶液：取10mL乙腈（4.3），0.3mL乙酸（4.6），用水稀释到100mL。4.18标准物质：AMOZ（CAS：43056-63-9）、SEM（CAS:563-41-7)、AHD（CAS:2827-56-7)和AOZCAS：80-65-9），纯度均≥99%。4.19同位素标记物标准物质：D;-AMOZ、13C15N-SEM、13C3-AHD和D,-AOZ。四种内标标准物质的纯度均≥99%。
4.201.0mg/mL标准储备溶液：分别称取适量的四种硝基喃代谢物标准物质（4.18），分别用甲醇稀释成1.0mg/mL的标准储备溶液。避光保存于一18℃冰柜中。4.210.1μg/mL混合标准溶液：分别吸取适量四种硝基呋喃代谢物的标准储备溶液（4.20），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。4.221.0mg/mL同位素标记物混合内标储备溶液：分别称取适量的四种硝基呋喃代谢物的同位素标记物标准物质（4.19），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中。4.230.1μg/mL同位素标记物混合内标溶液：分别移取适量的四种硝基呋哺代谢物的同位素标记物内标储备溶液（4.22），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合内标标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。4.24OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
4.25滤膜：0.2μm
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.3液体混匀器。
5.4固相萃取装置。
5.5氮气吹干仪。
5.6恒温振荡水浴。
5.7真空泵：真空度应达到80kPa。5.8微量注射器：25μL,100μL。5.9棕色具塞离心管：25mL50mL。5.10pH计：测量精度士0.02pH单位。5.11贴液器：50mL。
1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
5.12高速离心机：转速10000r/min以上。6试样的制备与保存
6.1试样的制备
实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。6.2试样保存
试样置于一18℃冰柜，避光保存。7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
7.1.1牛奶样品脱蛋白、水解和衍生化GB/T22987—2008
称取牛奶样品8g（精确到0.01g），置于50mL棕色离心管中，加人15mL三氯乙酸溶液（4.15）。向上述离心管中加人0.2mL衍生剂（4.16），再加人适量混合内标溶液（4.23），使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10min，上清液倒人另一棕色离心管中。7.1.2奶粉样品脱蛋白、水解和衍生化称取奶粉样品1g（精确到0.01g），置于50mL棕色离心管中，加人8mL水，涡旋混合后，再加人15mL三氯乙酸溶液（4.15）。向上述离心管中加入0.2mL衍生剂（4.16），再加人适量混合内标溶液（4.23），使四种硝基呋哺代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10min，上清液倒入另一棕色离心管中。
7.1.3样品溶液净化
上述衍生溶液加人5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.12)，用4mol/L氢氧化钠溶液（4.14)调节溶液pH约为7.4，在10000r/min下离心10min，上清液倒人下接OasisHLB固相萃取柱（4.24)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱（4.24），待样液全部通过固相萃取柱后用20mL20%甲醇水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。抽干OasisHLB固相萃取柱（4.24)15min。用5mL乙酸乙酯（4.4）洗脱，收集洗脱液于25mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上45℃水浴吹干，准确加人1.0mL样品定容溶液（4.17）溶解残渣，混勾后过0.2μm滤膜（4.25），供液相色谱-串联质谱测定。
7.2混合基质标准校准溶液的制备7.2.1牛奶混合基质标准校准溶液的制备称取五个阴性牛奶样品，每个样品为8g（精确到0.01g）。分别加人适量混合标准溶液（4.21），制成四种硝基呋哺代谢物含量均为0.1μg/kg、0.2μg/kg0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加人适量混合内标溶液（4.23），含量均为2.0ng/mL。同7.1.1和7.1.3操作，作为牛奶标准校准曲线。
7.2.2奶粉混合基质标准校准溶液的制备称取五个阴性奶粉样品，每个样品为1g（精确到0.01g）。分别加人适量混合标准溶液（4.21），制成四种硝基呋代谢物含量均为0.8μg/kg、1.6μg/kg、4.0μg/kg、8.0μg/kg和16.0μg/kg的基质标准溶液，再分别加人适量混合内标溶液（4.23），含量均为2.0ng/mL。同7.1.2和7.1.3操作，作为奶粉标准校准曲线。
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
GB/T22987—2008
色谱柱：AtlantisCig，3.5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者；柱温：35℃；
进样量：40μL；
流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱参考条件见表1。
表1液相色谱梯度洗脱参考条件
时间/min
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
流速/（μL/min）
离子源：电喷雾离子源（ESI)；扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM)；电喷雾电压（IS)：5000V；
辅助气（AUX）流速：7L/min；
辅助气温度（TEM)：480℃；
聚焦电压（FP）：150V；
碰撞室出口电压（CXP)：11V；
去簇电压（DP)：45V；
流动相A/%
四种硝基味哺代谢物和内标衔生物的质谱参数见表2。表2
衍生后的硝基呋哺代谢物
及同位素内标物名称
2-NP-AMOZ
2-NP-SEM
2-NP-AHD
2-NP-AOZ
2-NP-Ds-AMOZ
2-NP-13C15N-SEM
2-NP-13C-AHD
2-NP-D,-AOZ
四种硝基喃代谢物和内标衍生物的质谱参数定性离子对
335/291
335/128
209/192
209/166
249/134
249/178
236/134
236/192
340/296
212/168
252/134
240/134
定量离子对
335/291
209/166免费标准下载网bzxz
249/134
236/134
340/296
212/168
252/134
240/134
去簇电压
(DP)/V
流动相B/%
采集时间/
碰撞能量
(CE)/V
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性确证
GB/T22987—2008
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在土2.5%之内；且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.2定量测定
20内标法定量：用仪器软件中的内标定量程序10K≤10
外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对四种硝基哺代谢物的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中得测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。四种硝基味代谢物及内标衍生物的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B中的图B.1。四种硝基呋喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录C中的表C.1。7.5平行试验
按试样步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
不称取样品，其余均按试样步骤进行。7.7回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，除不加内标溶液外，均按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。
8结果计算
四种硝基呋哺代谢物的测定按式(1)计算：会xx
Vx1000
X=c××%×*×
式中：
试样中被测物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；Cs
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样溶液中被测物的色谱峰面积；基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；V
样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：m
试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
..（1)
GB/T22987--2008
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限，四种硝基呋喃代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程硝基呋哺代谢物的衍生物名称
2-NP-AMOZ
2-NP-SEM
2-NP-AHD
2-NP-AOZ
添加浓度范围/（μg/kg）
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限
再现性限R
lgr=0.8950lgm-1.0874IgR=0.9448lgm-0.7116lgr=1.1209lgm-1.0110igR=0.9787lgm-0.7317lgr=0.8502lgm-1.0206
lgR=1.0293lgm0.7095
lgr=1.0710lgm-0.8852
lgR=0.9933lgm0.7008
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，四种硝基呋哺代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表4。6
附录A
（资料性附录）
四种硝基呋哺及代谢物的中英名称及英文缩写GB/T22987—2008
喃它酮、味喃西林、味喃要因和味喃唑酮及代谢物的中英名称及英文缩写，见表A.1。表A.1呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物的中英名称及英文缩写四种硝基呋脯
中文名称
呋嘴它酮
呋哺西林
呋哺妥因
呋响唑酮
四种硝基呋喃
英文名称
furaltadon
nitrofurazone
nitrofurantoin
urazolidone
四种硝基呋喃代谢物中文名称
5-吗啉甲基-3-氨基-2-嗯唑烷
氨基脲
1-氨基-2-内酰脲
3-氨基-2-嗯唑烷基酮
四种硝基呋喃代谢物英文名称
3-amino-5-morpholinomethyl-l,3-oxazolidin-2-one
semicarbazide
1-aminohydantoin
3-amino-2-oxazolidinone
英文缩写
GB/T22987-2008
附录B
（资料性附录）
多反应监测（MRM）色谱图
四种硝基呋喃代谢物及内标衍生物的多反应监测(MRM)色谱图，见图B.1。1：04
15-吗琳甲基-3-氨基-2-嗯唑烷基酮的衍生物5
氮基腺的衍生物
8.52 1-氮基-2-内酰脲的衍生物77.83
3-氨基-2-啮唑烷基酮的衍生物
6.85 7.478.42
5-吗嘛甲基-3-氮基-2-嘧唑烷基酮内标物的衍生物o
氨基脲内标物的衍生物
41-氨基-2-内酰服内标物的衍生物9
3-氨基-2-呕唑烷基酮内标物的衍生物10
四种硝基喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测（MRM）色谱图15t/min
15t/min
15/min
15/min
15/min
15/min
15t/min
15t/min
附录C
（资料性附录）
回收率
四种硝基呋喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表C.1。GB/T22987—2008
表C.1四种硝基呋喃代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据基质样品
添加浓度/
(μg/kg)
奶粉和牛奶样品中四种硝基呋哺代谢物的平均回收率/%2-NP-AMOZ
2-NP-SEM
2-NP-AHD
2-NP-AOZ
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