DB 33/T 473-2004 β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类注链霉素型药物残留量的测定 DB33/T473-2004 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS07.100.30
备案号：14979-2004
方标准
DB33/T4732004
β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定
放射免疫快速检测法
Determination of beta-lactam,sulfa drugs and aminoglycoside-Stresidues--Radioimmunoassay
2004-02-04发布
2004-03-04实施
浙江省质量技术监督局发布
口体网
http：//foodmaate.net/
本标准由杭州市质量技术监督局、杭州市农业局共同提出。本标准由杭州市农产品检测站负责起草。本标准由浙江大学动物科学学院、华粤行仪器有限公司参加起草DB33/T4732004
本标准主要起草人：胡学肖、杨华、周方、袁谦、方维焕、邹黎明、李容、姚建红。1
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DB33/T473—2004
β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定放射免疫快速检测法
1范围
本标准规定了β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物残留量的测定方法。本标准适用于牛乳及其制品（生鲜乳、灭菌乳、乳粉等）和畜、禽等动物肌肉及内脏中β-内酰胺类和磺胺类药物残留的测定，以及牛乳及其制品中氨基糖苷类链霉素型药物（链霉素、双氢链霉素、庆大霉素）残留的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验用水规格和试验方法3原理
样品中残留的药物和药片中标记了1C或H的药物竞争结合其特异性受体，经免疫竞争反应后离心取沉淀物加入闪烁液，在液体闪烁计数器中计数1分钟，将计数值与标准溶液测定的计数值进行比较计算待测样品中药物的残留量。4试剂和溶液
应符合GB/T6682二级用水要求。4.2闪烁液
由放射免疫试剂盒公司提供。
4.3牛乳及其制品测定用CHARMII放射免疫试剂盒或其它公司同类产品4.3.1牛乳及其制品中β-内酰胺类药物测定用放射免疫试剂盒。包括：绿色和黄色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、青霉素G标准干粉等。4.3.2牛乳及其制品中磺胺类药物测定用放射免疫试剂盒。包括：白色和粉红色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、磺胺二甲嘧啶标准干粉等。DB33/T473—2004
4.3.3牛乳及其制品中氨基糖苷类链霉素型药物测定用放射免疫试剂盒。包括：白色和绿色药片、牛乳阴性对照浓缩干粉、链霉素标准干粉等。4.3.4牛乳阴性对照液配制：取出待测药物试剂盒中的牛乳阴性对照浓缩干粉瓶，加入100mL40℃左右的水，震荡混匀，冷却至0～7℃，备用。4.4动物组织测定用CHARMII放射免疫试剂盒或其它公司同类产品4.4.1动物组织中β-内酰胺类药物测定用放射免疫试剂盒。包括：绿色和黄色药片、组织阴性对照浓缩干粉、青霉素G标准干粉、萃取缓冲液干粉和M2缓冲液干粉等。4.4.2动物组织中磺胺类药物测定用放射免疫试剂盒。包括：白色和粉红色药片、组织阴性对照浓缩干粉、磺胺二甲嘧啶标准干粉、萃取缓冲液干粉和M2缓冲液干粉等。4.4.3萃取缓冲液配制：取出待测药物试剂盒中的萃取缓冲液干粉瓶，将瓶中干粉全部转移入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，震荡混匀，备用。4.4.4M2缓冲液配制：取出待测药物试剂盒中的M2缓冲液干粉瓶，加入50mL水，震荡混匀，备用。4.4.5组织阴性对照液配制：取出待测药物试剂盒中的组织阴性对照浓缩干粉瓶，加入10mL水，震荡混匀，将其全部加入30.0mL萃取缓冲液（4.4.3）中，在锥形瓶中混合均匀，备用。4.5青霉素G标准溶液和阳性对照液配制4.5.1青霉素G标准溶液配制
4.5.1.1青霉素G标准贮备液：浓度为1000ng/mL。取出β-内酰胺类药物试剂盒（4.3.1或4.4.1）中的青霉素G标准干粉瓶，准确加入10mL水，震荡混匀，备用。
4.5.1.2牛乳及其制品测定用青霉素G标准中间工作液：浓度为50ng/mL。吸取2.0mL青霉素G标准贮备液（4.5.1.1）和38.0mL牛乳阴性对照液（4.3.4），在锥形瓶中混合均匀，备用。
4.5.1.3牛乳及其制品测定用青霉素G标准工作液吸取1.5mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL青霉素G标准中间工作液（4.5.1.2），分别移至25mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成3，5，10，15，20ng/mL的标准系列。
4.5.1.4动物组织测定用青霉素G标准中间工作液：浓度为50ng/mL。吸取3.0mL青霉素G标准贮备液（4.5.1.1）、27.0mL组织阴性对照液（4.4.5）和30mL萃取缓冲液（4.4.3），在锥形瓶中混合均匀，备用。2
4.5.1.5动物组织测定用青霉素G标准工作液DB33/T4732004
吸取5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL、15.0mL青霉素G标准中间工作液（4.5.1.4），分别移至25mL容量瓶中，用萃取缓冲液（4.4.3）稀释定容至刻度，混合均勾，配制成10，15，20，25，30ng/mL的标准系列。
4.5.2青霉素G阳性对照液配制
4.5.2.1牛乳及其制品测定用青霉素G阳性对照液：浓度为5ng/mL。吸取1.0mL青霉素G标准中间工作液（4.5.1.2）和9mL牛乳阴性对照液（4.3.4），在小烧杯中混合均匀。
4.5.2.2动物组织测定用青霉素G阳性对照液：浓度为12.5ng/mL。吸取0.3mL青霉素G标准贮备液（4.5.1.1），加入到5.7mL组织阴性对照溶液（4.4.5）中，在小烧杯中混合均匀，然后从中吸取2.0mL混合溶液，加入到6.0mL萃取缓冲液（4.4.3）中，在小烧杯中混合均匀。
4.6磺胺二甲嘧啶标准溶液和阳性对照液配制4.6.1磺胺二甲嘧啶标准溶液配制4.6.1.1磺胺二甲嘧啶标准贮备液：浓度为1000ng/mL。取出磺胺类药物试剂盒（4.3.2或4.4.2）中的磺胺二甲嘧啶标准干粉瓶，准确加入10mL水，震荡混匀，备用。
4.6.1.2牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧啶标准中间工作液：浓度为50ng/mL。吸取3.0mL磺胺二甲啶标准贮备液（4.6.1.1）和57.0mL牛乳阴性对照液（4.3.4)，在锥形瓶中混合均匀，备用。
4.6.1.3牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧标准工作液吸取5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL、15.0mL磺胺二甲嘧啶标准中间工作液（4.6.1.2），分别移至25mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成10，15，20，25，30ng/mL的标准系列。
4.6.1.4动物组织测定用磺胺二甲嘧啶标准中间工作液：浓度为50ng/mL。吸取3.0mL磺胺二甲嘧标准贮备液（4.6.1.1）、27.0mL组织阴性对照液（4.4.5）和30mL萃取缓冲液（4.4.3)，在锥形瓶中混合均匀，备用。4.6.1.5动物组织测定用磺胺二甲嘧啶标准工作液吸取5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL、15.0mL磺胺二甲嘧啶标准中间工作液（4.6.1.4），分别移3
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至25mL容量瓶中，用萃取缓冲液（4.4.3）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成10，15，20，25，30ng/mL的标准系列。
4.6.2磺胺二甲嘧啶阳性对照液配制4.6.2.1牛乳及其制品测定用磺胺二甲嘧啶阳性对照液：浓度为10ng/mL。吸取2.0mL磺胺二甲啶标准中间工作液（4.6.1.2）和8mL牛乳阴性对照液（4.3.4），在小烧杯中混合均匀。
4.6.2.2动物组织测定用磺胺二甲嘧阳性对照液：浓度为12.5ng/mL。吸取0.3mL磺胺二甲嘧啶标准贮备液（4.6.1.1)，加入到5.7mL组织阴性对照溶液（4.4.5）中，在小烧杯中混合均匀，然后从中吸取2.0mL混合溶液，加入到6.0mL萃取缓冲液（4.4.3）中，在小烧杯中混合均匀。
4.7链霉素标准溶液和阳性对照液配制4.7.1链霉素标准溶液配制
4.7.1.1链霉素标准贮备液：浓度为10000ng/mL。取出氨基糖苷类链霉素型药物试剂盒（4.3.3）中的链霉素标准干粉瓶，准确加入10mL水，震荡混匀，备用。
4.7.1.2牛乳及其制品测定用链霉素标准中间工作液：浓度为100ng/mL。吸取0.5mL链霉素标准贮备液（4.7.1.1），加入到50mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，备用。4.7.1.3牛乳及其制品测定用链霉素标准工作液吸取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL链霉素标准中间工作液（4.7.1.2），分别移至25mL容量瓶中，用牛乳阴性对照液（4.3.4）稀释定容至刻度，混合均匀，配制成10，20，30，40，50ng/mL的标准系列。
4.7.2链霉素阳性对照液配制
4.7.2.1牛乳及其制品测定用链霉素阳性对照液：浓度为25ng/mL。吸取2.0mL链霉素标准中间工作液（4.7.1.2）和6mL牛乳阴性对照液（4.3.4），在小烧杯中混合均匀。
5仪器和设备
5.1CHARMII6600/7600分析仪或其它同类产品。5.2分析天平：最小感量为0.01g4
全品秋全
5.3可调温加热器或水浴锅：20℃—100℃（温度精度±0.1℃）。5.4离心机：转速不低于3300转/分5.5高速组织分散机：转速不低于10000转/分。5.6旋涡混合器。
5.7普通冰箱：带冷冻室。
5.8冰袋
5.9连续可调移液器及配套吸头：200uL1000uL、1ml—5mL。5.10专用试管及配套盖子：Φ13mm×100mm，与分析仪配套。脱脂棉签。
5.12实验室常规玻璃器血。
6分析步骤
6.1样品制备
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6.1.1液态牛乳：采取具有代表性的液态牛乳（生鲜乳、灭菌乳等）1000mL，放入冰箱中冷却至0~7℃，密封保存，备用。生鲜乳保存期不超过5天，灭菌乳保存期不超过其规定时间。6.1.2乳粉：采取具有代表性的样品1kg，用四分法缩减至约250g，混匀，装入样品瓶内室温下密封保存，备用。
6.1.3动物组织：采取具有代表性的样品1kg，放冰箱冷藏室中保存（5天内不测定的样品须冷冻保存），备用。
6.2提取
6.2.1液态牛乳：将待测牛乳混匀，取20mL，测定前在3300rpm的转速下离心5分钟，去除上层脂肪下层牛乳样品直接用于药物残留测定。6.2.2乳粉：称取2g待测乳粉，加入20mL水，溶解混匀，冷却至0～7℃，备用。全脂乳粉溶解混匀后，先在3300rpm的转速下离心5分钟，去除上层脂肪。6.2.3动物组织：切下约50g全精肌肉或内脏，将其剩碎或绞碎，称取10g样品加入到50mL离心管中，同时加萃取缓冲液（4.4.3）至40mL刻度处。将离心管中的组织和缓冲液全部倒入小烧杯中，用高速组织分散机均质1分钟（处理不同样品时必须用水清洗分散头以避免交叉污染）。将均质物摇匀后倒回原来的离心管中，将离心管放置在80±2℃的加热器中恒温规定时间（β-内酰胺类药物30分钟，磺胺类药物45分钟)，取出后放置在冰水浴中冷却10分钟。将混合物在3300rpm的转速下离心10分钟，取上清液，用M2缓冲液（4.4.4）将pH值调至7.5左右，备用5Www.bzxZ.net
6.3免疫竞争反应
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将含有待测药物特异性受体的药片（颜色见表1）放入到空试管（5.9）中，加300μL水，旋涡混合约10秒钟。加入规定体积（体积见表1）的试液（阴性对照液、阳性对照液、标准工作液、牛乳及其制品或动物组织样液），旋涡混合约10秒钟，立即加入含有4C或H同位素的药片（颜色见表1)），在旋涡混合器上混合约15秒钟；在规定温度（温度见表1）下加热3分钟，在3300rpm的转速下离心3分钟。取出试管，弃去上清液，并用脱脂棉签擦去残留在试管壁上的脂肪和液滴（注意不要接触到沉淀物）。加300μL水，在旋涡混合器上将沉淀物打碎；最后加入3.0mL闪烁液，旋涡混合约10秒钟，并在试管上加上配套盖子，备用。表1免疫竞争反应条件
药物类型
β-内酰胺类
磺胺类
氨基糖苷类
链霉素型
6.4测定
试液类别
牛乳及其制品
动物组织
牛乳及其制品
动物组织
牛乳及其制品
6.4.1试剂和仪器有效性确认
受体药片
的颜色
同位素药片
的颜色
粉红色
粉红色
试液体积
加热温度
85±1℃
55±1℃
85±1℃
65±1℃
35±1℃
检测阴性对照液和阳性对照液各3次，求出其每分钟液体闪烁次数（CPM值）的平均值，与试剂盒出厂计数单对比，阳性对照CPM平均值除以阴性对照CPM平均值应与出厂计数单上的比值相近，允许偏差为土0.1，但不能超过0.7（如超出允许范围，应重做或者与厂家联系）。6.4.2测定
将标准工作液和待测样液依次在CHARMII6600/7600分析仪或其它同类产品上进行60秒钟的读数，各读三次，分别记录每次的CPM值。测定β-内酰胺类药物时，读取[CI频道上的CPM值；测定磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物时，读取[\H频道上的CPM值。7分析结果计算和表述
7.1标准工作曲线绘制
以待测药物标准工作液的浓度值（C）为横坐标，对应的CPM值（CPM）为纵坐标，绘制标准工作曲线。
7.2结果计算
样品中待测药物残留量（ug/kg)按下式计算：6
食品伙伴区
式中：℃
待测药物残留量（ug/kg)=V·C/m由标准工作曲线求得的待测样液CPM值所对应的浓度，ng/mL；m—试样的质量，g;
V—试样提取液体积，mL。
3检出限与允许差
8.1检出限
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牛乳及其制品中β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类链霉素型药物的检出限依次为3ug/kg、10μg/kg、10μg/kg；动物组织中β-内酰胺类和磺胺类药物的检出限分别为10μg/kg、10μg/kg8.2充许差
每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。其分析结果的相对偏差应不大于10%。其他
本法为半定量快速测定法，当检验结果出现异议时，以国家标准方法为准7
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