GB/T 26425-2010
基本信息
标准号： GB/T 26425-2010
中文名称：饲料中产气荚膜梭菌的检测
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB/T 26425-2010 饲料中产气荚膜梭菌的检测
GB/T26425-2010
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标准内容
ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T26425—2010
饲料中产气荚膜梭菌的检测
Method for determination of Clostridium perfringens in feeds(ISO 7937:2004,Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens-Colony-count technique,MOD)
2011-01-14发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-07-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。GB/T26425-—2010
本标准使用重新起草法修改采用ISO7937：2004《食品和动物饲料的微生物学产气英膜梭菌计数的水平方法茵落计数技术》英文版）。本标准与ISO7937:2004相比在结构上有较多调整，附录B中列出了本标准与ISO7937:2004的章条编号对照一览表。
本标准与IS07937：2004相比存在技术性差异，这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线（「）进行了标识，附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改：删除了ISO7937：2004的目次；
删除了ISO7937：2004的引言；
删除了ISO7937：2004的参考文献。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。本标准起草单位：广东省微生物分析检测中心，本标准主要起草人：朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜姣。T
1范围
饲料中产气莱膜梭菌的检测
本标准规定了伺料中产气美膜梭菌的检验方法。本标准造用于饲料中产气英膜梭菌的检测。2规范性引用文件
GB/T26425—2010
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注甘期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.12005,ISO6497：2002.IDT)GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006,ISO6498：1998，IDT）SN/T1538.1一2005培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则(SN/T1538.1—2005IS0/TS11133-1:2000MOD)SN/T1538.2—2007培养基制备指南：第2部分：培养基性能测试实用指南（SN/T1538.2-2007,ISO/TS11133-2:2003,MOD)3原理
3.1在平板中接种特定量测液体样品，或特定量其他类型待测样品初始悬液。在相同条件下接种待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。浇注一层选择性培养基，凝固后再浇注一层此培养基覆盖。3.2平板于37℃厌氧培养20h士2h。3.3典型菌落计数。
3.4典型菌落的数量用确证试验证实，进一步计算每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数。4稀释液、培养基及试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。
4.1蛋白陈生理盐水稀释液：参见附录A中的A.1。4.2亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC)：参见附录A中的A.2。注：该培养基原称为无卵黄胰蛋白陈-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC)。4.3液体硫乙醇酸盐培养基：参见附录A中的A,3。4.4乳糖亚硫酸盐（LS)培养基(可选）：参见附录A中的A.4。4.5动力硝酸盐培养基（可选）：参见附录A中的A.5。4.6硝酸盐还原试剂(可选）：参见附录A中的A.6.4.7锌粉（可选）：可选。
4.8乳糖-明胶培养基（可选）：参见附录A中的A.7。1
GB/T26425—2010
5设备和玻璃器皿
需配备微生物学常规设备和以下设备及玻璃器皿。5.1干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。5.2恒温培养箱：37℃±1℃。
5.3厌氧培养装置或厌氧罐。
5.4pH计：精度到士0.1个单位。5.5接种环、穿刺接种针：铂金丝或镍丝，一次性使用的无菌用品亦可，接种环直径约3mm，5.6过滤除菌装置：用于溶液过滤除菌。5.7试管、销形瓶、倒管：容积适当，试管16mm×160mm。5.8吸管：1mL（具0.1mL刻度），10mL（具0.5mL刻度）。5.9玻璃或塑料平板：直径9cm~10cm。5.10水浴锅：46℃±0.5℃，44℃～47℃可调。5.11橡胶吸耳球：必要时与具刻度的移液管一同用于配制硝酸盐还原试剂。6采样
实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子，匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。样品的制备
按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。8操作步骤
8.1检样制备、初始悬液和十倍稀释以无菌操作称取试样25g（mL）加入225mL蛋白陈生理盐水稀释液（4.1），均质1min～2min，制成110的稀释液。吸取1：10的稀释液1mL，加人9mL蛋白陈生理盐水稀释液，经充分混匀后制成1：100的稀释液。更高稀释度可按此方法操作，8.2接种和培养
用无菌移液管吸取1mL初始悬液（若样品本身为液体，则直接吸取样液）加人到灭菌空平血中央，每个样品做两个重复，每个平板浇注44℃~47℃水浴保温的SC培养基（4.2）10mL～15mL，柔和转动平板，使稀释液与培养基充分混勾。培养基凝固后，再于其上浇注10mL的SC培养基，待其凝固后，将平板倒置于厌氧培养装置（5.3)内，37℃厌氧培养20h士2h。培养时间不宜过长，否则会导致平板冠过度黑化。
采用同样操作步骤进行1：100的稀释物的接种和培养，必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。
8.3计数及菌落筛选
培养后，选择长有150个菌落以下的平板，最好选择连续稀释度的平板，计数每亚中黑色菌落。然2
后从中选出5个黑色菌落用8.4.1或8.4.2中的任一种方法做确证试验。8.4确证试验
8.4.1用LS培养基进行确证试验
GB/T26425—2010
注：因只有产气膜梭菌和不和谐梭菌(Ciartridiumaasamm)这两种菌能在LS培养基（4.4)上46C培养下生长故采用此法进行确证试验不需确保从SC培养基上选出的黑色菌落为纯培养即可转接至液体硫乙醇酸盐培养基进而转接到LS培养基上。
8.4.1.1培养及转种
将每个选出的菌落接种至液体硫乙醇酸盐培养基（4.3），37℃厌氧培养18h～24h后，立即用灭菌移液管将5滴液体硫乙醇酸盐培养物转接到LS培养基中，水浴（5.10)中46℃需氧培养18h24h，8.4.1.2鉴别
检查LS培养基中的倒管是否产气且是否星黑色（为亚硫酸铁沉淀），LS培养基变黑且产气超过1/4小倒管的可确认为阳性，若LS培养基变黑但产气不足1/4小倒管的，立即从中转接5滴至另一管LS培养基，于水浴中46℃培养18h～24h后，同上判断是否阳性。在SC培养基上形成特征性菌落，且用LS培养基确认为阳性的可认定为产气英膜梭菌，其他情况均应判为阴性。
8.4.2用动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基进行确证试验8.4.2.1概述
用此法进行确证需确保用于确证的菌落得到良好分离。平板表面出现过度生长或不可能选出良好分离的特征菌落时，应将5个特征菌落接种至预脱气的液体硫乙醇酸盐培养基，37℃厌氧培养18h～24h后，划线于SC基础琼脂平板（A.2.1)上，待划线干后，再覆盖10mLSC基础琼脂，凝固后置37℃厌氧培养18h～24h后，从每平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，必要时重复于SC基础琼脂上划线及培养，直至获得良好分离的黑色菌落。再如8.4.2.2、8.4.2.3和8.4.2.4所述进行确证试验。8.4.2.2动力硝酸盐培养基确证
将选出的菌落穿刺接种至新鲜脱气的动力硝酸盐培养基4.5），37℃厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，沿接种线周围呈扩散生长的为有动力，然后用有刻度的滴管和橡胶吸耳球滴加硝酸盐还原试剂（4.6)0.2mL~0.5mL，观察硝酸盐是否被还原，变红的为阳性。若15min内无红色产生，加少量锌粉10min后观察结果，此时若变红则表明无硝酸盐被还原，判为阴性。产气英膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
警告：为了安全起见，滴加硝酸盐还原试剂应在通风橱中进行。B.4.2.3转种及乳糖-明胶培养基确证试验将选出的菌落穿刺接种至新鲜脱气的乳糖-明胶培养基（4.8），37℃厌氧培养24h，观察是否发酵乳糖，发酵乳糖者产气且变黄（因产酸），5℃放置1h，据其是否凝固检查明胶液化与否。此培养基凝固者，接着再培养24 h，以检查明胶液化与否。8.4.2.4鉴别
SC培养基上形成黑色菌落，无动力，能还原硝酸盐，发酵乳糖产酸产气，48h内液化明胶者可判为3
GB/T26425—2010
产气英膜梭菌。产气英膜梭菌的硝酸盐还原反应迅速且强烈，仅有微弱硝酸盐还原反应（如变成桃红色)者，应排除。
9结果计算与报告
9.1每个平板中产气荚膜梭菌的数量每个平板中产气英膜梭菌菌落数α的计算见式(1)：a-xc
式中：
α—-每块平板上的产气荚膜梭菌菌落数；5—挑取后经证实为产气荚膜梭菌的菌落数；A—挑取平板上用于验证的菌落数；C——-平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例：
若某板上长有30个典型菌落，从中选出做确证试验的5个菌中有4个证实为产气美膜梭菌，则：×30-24
9.2试样中产气英膜梭菌菌数的计算方法与报告9.2.1通常情况下试样中产气英膜梭菌数的计算方法与报告（1）
选择两个连续稀释度平板（其上经确证后的产气英膜梭菌数介于15～150之间），按式（2）计算1mL或1g试样中的产气荚膜梭菌茵数N：Ma
N=V(n+0. 1na)a
N-样品中产气荚膜梭菌菌落数；Za——所有平板经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和；V
平板的接种体积，单位为毫升（mL）一第一个稀释度的平板数；
一第二个稀释度的平板数；
d一一第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。(2)
按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可记录为1.0～9.9乘以10 的指数幂形式。
报告每毫升或每克试样中产气荚膜梭菌数量，单位为CFU/g(mL)。示例1：
若第一个稀释度（10-\）经确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度（10-3）经确证后的菌落数为14和15，则：168+215+14+15
N=1(2+0.110-0.022
-19182
报告每毫升或每克试样中含产气美膜梭菌数量为1.9×10*CFU/g(mL)或19000CFU/g(mL)。示例2：
只有一个稀释度平板上含少于150个确证为产气英膜梭菌菌落数，如最后一稀释液（10-）经证实含产气英膜梭菌菌落数分别为120和130，则：
120+130
1×2×10
=1250.000
GB/T26425—2010
报告每毫升或每克试样中含产气膜梭菌数量为1.2×10*CFU/g(mL)或1200000CFU/g（mL)。9.2.2经确证后的产气英膜梭菌茵菌数很少的情况下的计算方法与报告9.2.2.1仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含产气英膜梭菌，且均少于15仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含产气荧膜梭菌，且均少于15时，按式（3)计算1mL或1g样品中的产气英膜梭菌数Ne。a
式中：
Ne样品中产气英膜梭菌菌数；
一两个被选择平板中经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和；平板的接种体积，单位为毫升（mL）；d-稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的d值为1)。报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量。示例1：
某固体样品初始悬液的菌落数分别为8和6，则：Ne
1×2×10-1
报告每克试样中含产气英膜梭菌菌数为70CFU/g。14
9.2.2.2液体测试样品原液或其他样品的初始悬液经确证后不含产气英膜梭菌（3)
报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量小于1/d(d为液体测试样品原液或其他样品的初始悬液的稀释因子，未经稀释的液体样品d值为1)。GB/T26425—2010
A.1蛋白陈生理盐水
A.1.1成分
酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
1000mL
附录A
（资料性附录）
培养基和试剂
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.0士0.2。A,2亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC)A.2. 1基础培养基
A.2.1.1成分
蛋白陈
大豆蛋白陈
酵母粉
偏重亚硫酸钠(Na,S,O,)
柠檬酸铁铵1
蒸馏水
A.2. 1.2制法
9.0 g~18.0 g2)
1000mL
各成分加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.6士0.2，分装，121℃灭菌15min，5℃士3℃最多可保存2周。
某些情况下（见8.4.2.1)，可能应制备SC琼脂基础培养基平板用于动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基确证试验，因此，将约15mL基础培养基浇注平板（水裕融解后冷却至约44℃～47℃），使之凝固。平板干燥后立即使用。
A.2.2D-环丝氨酸溶液
A.2.2.1成分
D-环丝氨酸?
1）此试剂含铁质量分数应不少于15%2）据凝胶强度而定。
3）仅能使用白色结品粉末。
蒸馏水
A.2.2.2制法
D-环丝氨酸溶于蒸馏水，过滤除菌。3℃士2℃最多可保存4周。A.2.3完全培养基
GB/T26425—2010
临用前，每100mL灭菌的基础培养基（A.2.1)冷却至约44℃～47℃后，加人1mLD-环丝氨酸溶液(A.2.2),立即瓷注平板。
A.2.4SC培养基质量保证和性能测试选择性和生长率试验，见SN/T1538.1-2005。性能测试见SN/T1538.2—2007中的表B.1L见TS(C)]。
A.3液体硫乙醇酸盐培养基
A.3.1成分
酪蛋白陈
L-胱氨酸
D-葡萄糖
酵母粉
氯化钠
硫代乙醇酸钠
刃天青
蒸馏水
A.3.2制法
0.5g~2.0g*
1000mL
加热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.1士0.2，分装每管10mL，121℃高压灭菌15min。使用前需脱气。
A.3.3液体硫乙醇酸盐培养基质量保证和性能测试选择性及生长率测定见SN/T1538.1--2005。性能测试见SN/T1538.22007中的表B.4。A.4乳糖亚硫酸盐(LS)培养基(可选)A.4.1基础培养基
A.4.1.1成分
酪蛋白陈
醇酵母粉
氯化钠
据琼脂凝胶强度面定。
GB/T26425—-2010
L-半胱氨酸盐酸盐
蒸馏水
A.4. 1.2制法
1000mL
溶解各成分（必要时可煮沸溶解）。调整PH值，使培养基pH值在25℃时为7.1士0.2。分装至带有小倒管（Durham小管）的试管中，每管8mL，121℃高压灭菌15min。3℃土2℃最多可保存4周。A.4.2焦亚硫酸钠溶液
A.4.2.1成分
无水焦亚硫酸钠（NazS.O）1.2g蒸馅水
A.4.2.2制法
将焦亚硫酸钠溶于蒸馏水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.3柠檬酸铁铵溶液
A.4.3.1成分
柠檬酸铁铵
蒸馏水
将柠檬酸铁铵溶于蒸馏水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.4完全培养基
培养基若非当天使用，临用前需迅速加热并冷却使之脱气。若培养基装于螺旋盖的瓶中，加热前松开瓶盖，冷却前则拧紧瓶盖。加焦亚硫酸钠溶液（A.4.2)和柠檬酸铁铵溶液（A.4.3)各0.5mL至8mL的基础培养基(A.4.1)中。完全培养基应当天使用。A.5动力硝酸盐培养基（可选）
A.5.1成分
酪蛋白陈
牛肉膏
半乳糖
硝酸钾（KNO.）
磷酸氢二钠（NaHPO）
蒸馏水
5）据琼脂凝胶强度而定。
1. 0 g~5. 0 g5)
1000mL
A.5.2制法
GB/T26425—2010
加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.3士0.2,分装，每管10mL，121℃高压灭菌15min。培养基若非当天使用，于5℃士3℃保存，临用前水浴或蒸汽浴中加热15min后迅速冷却至培养温度使之脱气。5℃士3℃最多可保存4周。A.6硝酸盐还原试剂（可选）
A.6.15-氨基-2-萘磺酸(5-2-ANSA)溶液将5-氨基-2-萘磺酸0.1g溶解于15%（体积分数）的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中（最好具球形滴器），5℃士3℃贮存。A.6.2磺胺酸溶液
将磺胺酸0.4g溶于15%（体积分数）的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中（最好具球形滴器），5℃士3℃贮存。A.6.3完全试剂的用法
临用前等比例混合以上两种溶液（A.6.1及A.6.2)，多余试剂弃去。A.7乳糖-明胶培养基（可选）
A.7.1成分
酪蛋白陈bZxz.net
酵母粉
蒸馏水
A.7.2制法
1000mL
除乳糖和酚红外，溶解其余各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.5士0.2，加乳糖和酚红，分装，每管10mL，121℃高压灭菌15min。若当天不用，于5℃士3℃保存。过期弃去。临用前，于沸水或流动蒸汽中加热15min，然后迅速冷却至培养温度。5℃士3℃最多可保存3周。9
GB/T26425—2010
附录B
（资料性附录）
本标准与IS07937：2004相比的结构变化情况本标准与ISO7937：2004相比在结构上有较多调整，具体章条编号对照情况见表B.1。表B.1本标准与IS07937：2004的章条编号对照情况本标准章条编号
附录A
A.2.1~A.2. 4
A.3.1~A.3.3
A. 4.1~A 4. 4
A,5.1~A, 5.2
A.6.1~A.6.3
A. 7.1~A. 7. 2
附录B
附录C
对应的国际标准章条编号
5. 2. 1~5. 2. 4
5. 3. 1~5. 3. 3
5.4.1~5.4.4
5.5.1~5,5.2
5.6.1~5.5.3
5.8. 1~5.8.2
附录 A
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饲料中产气荚膜梭菌的检测
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本标准与IS07937：2004相比存在技术性差异，这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线（「）进行了标识，附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改：删除了ISO7937：2004的目次；
删除了ISO7937：2004的引言；
删除了ISO7937：2004的参考文献。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。本标准起草单位：广东省微生物分析检测中心，本标准主要起草人：朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜姣。T
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本标准规定了伺料中产气美膜梭菌的检验方法。本标准造用于饲料中产气英膜梭菌的检测。2规范性引用文件
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3.1在平板中接种特定量测液体样品，或特定量其他类型待测样品初始悬液。在相同条件下接种待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。浇注一层选择性培养基，凝固后再浇注一层此培养基覆盖。3.2平板于37℃厌氧培养20h士2h。3.3典型菌落计数。
3.4典型菌落的数量用确证试验证实，进一步计算每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数。4稀释液、培养基及试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。
4.1蛋白陈生理盐水稀释液：参见附录A中的A.1。4.2亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC)：参见附录A中的A.2。注：该培养基原称为无卵黄胰蛋白陈-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC)。4.3液体硫乙醇酸盐培养基：参见附录A中的A,3。4.4乳糖亚硫酸盐（LS)培养基(可选）：参见附录A中的A.4。4.5动力硝酸盐培养基（可选）：参见附录A中的A.5。4.6硝酸盐还原试剂(可选）：参见附录A中的A.6.4.7锌粉（可选）：可选。
4.8乳糖-明胶培养基（可选）：参见附录A中的A.7。1
GB/T26425—2010
5设备和玻璃器皿
需配备微生物学常规设备和以下设备及玻璃器皿。5.1干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。5.2恒温培养箱：37℃±1℃。
5.3厌氧培养装置或厌氧罐。
5.4pH计：精度到士0.1个单位。5.5接种环、穿刺接种针：铂金丝或镍丝，一次性使用的无菌用品亦可，接种环直径约3mm，5.6过滤除菌装置：用于溶液过滤除菌。5.7试管、销形瓶、倒管：容积适当，试管16mm×160mm。5.8吸管：1mL（具0.1mL刻度），10mL（具0.5mL刻度）。5.9玻璃或塑料平板：直径9cm~10cm。5.10水浴锅：46℃±0.5℃，44℃～47℃可调。5.11橡胶吸耳球：必要时与具刻度的移液管一同用于配制硝酸盐还原试剂。6采样
实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子，匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。样品的制备
按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。8操作步骤
8.1检样制备、初始悬液和十倍稀释以无菌操作称取试样25g（mL）加入225mL蛋白陈生理盐水稀释液（4.1），均质1min～2min，制成110的稀释液。吸取1：10的稀释液1mL，加人9mL蛋白陈生理盐水稀释液，经充分混匀后制成1：100的稀释液。更高稀释度可按此方法操作，8.2接种和培养
用无菌移液管吸取1mL初始悬液（若样品本身为液体，则直接吸取样液）加人到灭菌空平血中央，每个样品做两个重复，每个平板浇注44℃~47℃水浴保温的SC培养基（4.2）10mL～15mL，柔和转动平板，使稀释液与培养基充分混勾。培养基凝固后，再于其上浇注10mL的SC培养基，待其凝固后，将平板倒置于厌氧培养装置（5.3)内，37℃厌氧培养20h士2h。培养时间不宜过长，否则会导致平板冠过度黑化。
采用同样操作步骤进行1：100的稀释物的接种和培养，必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。
8.3计数及菌落筛选
培养后，选择长有150个菌落以下的平板，最好选择连续稀释度的平板，计数每亚中黑色菌落。然2
后从中选出5个黑色菌落用8.4.1或8.4.2中的任一种方法做确证试验。8.4确证试验
8.4.1用LS培养基进行确证试验
GB/T26425—2010
注：因只有产气膜梭菌和不和谐梭菌(Ciartridiumaasamm)这两种菌能在LS培养基（4.4)上46C培养下生长故采用此法进行确证试验不需确保从SC培养基上选出的黑色菌落为纯培养即可转接至液体硫乙醇酸盐培养基进而转接到LS培养基上。
8.4.1.1培养及转种
将每个选出的菌落接种至液体硫乙醇酸盐培养基（4.3），37℃厌氧培养18h～24h后，立即用灭菌移液管将5滴液体硫乙醇酸盐培养物转接到LS培养基中，水浴（5.10)中46℃需氧培养18h24h，8.4.1.2鉴别
检查LS培养基中的倒管是否产气且是否星黑色（为亚硫酸铁沉淀），LS培养基变黑且产气超过1/4小倒管的可确认为阳性，若LS培养基变黑但产气不足1/4小倒管的，立即从中转接5滴至另一管LS培养基，于水浴中46℃培养18h～24h后，同上判断是否阳性。在SC培养基上形成特征性菌落，且用LS培养基确认为阳性的可认定为产气英膜梭菌，其他情况均应判为阴性。
8.4.2用动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基进行确证试验8.4.2.1概述
用此法进行确证需确保用于确证的菌落得到良好分离。平板表面出现过度生长或不可能选出良好分离的特征菌落时，应将5个特征菌落接种至预脱气的液体硫乙醇酸盐培养基，37℃厌氧培养18h～24h后，划线于SC基础琼脂平板（A.2.1)上，待划线干后，再覆盖10mLSC基础琼脂，凝固后置37℃厌氧培养18h～24h后，从每平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，必要时重复于SC基础琼脂上划线及培养，直至获得良好分离的黑色菌落。再如8.4.2.2、8.4.2.3和8.4.2.4所述进行确证试验。8.4.2.2动力硝酸盐培养基确证
将选出的菌落穿刺接种至新鲜脱气的动力硝酸盐培养基4.5），37℃厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，沿接种线周围呈扩散生长的为有动力，然后用有刻度的滴管和橡胶吸耳球滴加硝酸盐还原试剂（4.6)0.2mL~0.5mL，观察硝酸盐是否被还原，变红的为阳性。若15min内无红色产生，加少量锌粉10min后观察结果，此时若变红则表明无硝酸盐被还原，判为阴性。产气英膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
警告：为了安全起见，滴加硝酸盐还原试剂应在通风橱中进行。B.4.2.3转种及乳糖-明胶培养基确证试验将选出的菌落穿刺接种至新鲜脱气的乳糖-明胶培养基（4.8），37℃厌氧培养24h，观察是否发酵乳糖，发酵乳糖者产气且变黄（因产酸），5℃放置1h，据其是否凝固检查明胶液化与否。此培养基凝固者，接着再培养24 h，以检查明胶液化与否。8.4.2.4鉴别
SC培养基上形成黑色菌落，无动力，能还原硝酸盐，发酵乳糖产酸产气，48h内液化明胶者可判为3
GB/T26425—2010
产气英膜梭菌。产气英膜梭菌的硝酸盐还原反应迅速且强烈，仅有微弱硝酸盐还原反应（如变成桃红色)者，应排除。
9结果计算与报告
9.1每个平板中产气荚膜梭菌的数量每个平板中产气英膜梭菌菌落数α的计算见式(1)：a-xc
式中：
α—-每块平板上的产气荚膜梭菌菌落数；5—挑取后经证实为产气荚膜梭菌的菌落数；A—挑取平板上用于验证的菌落数；C——-平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例：
若某板上长有30个典型菌落，从中选出做确证试验的5个菌中有4个证实为产气美膜梭菌，则：×30-24
9.2试样中产气英膜梭菌菌数的计算方法与报告9.2.1通常情况下试样中产气英膜梭菌数的计算方法与报告（1）
选择两个连续稀释度平板（其上经确证后的产气英膜梭菌数介于15～150之间），按式（2）计算1mL或1g试样中的产气荚膜梭菌茵数N：Ma
N=V(n+0. 1na)a
N-样品中产气荚膜梭菌菌落数；Za——所有平板经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和；V
平板的接种体积，单位为毫升（mL）一第一个稀释度的平板数；
一第二个稀释度的平板数；
d一一第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。(2)
按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可记录为1.0～9.9乘以10 的指数幂形式。
报告每毫升或每克试样中产气荚膜梭菌数量，单位为CFU/g(mL)。示例1：
若第一个稀释度（10-\）经确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度（10-3）经确证后的菌落数为14和15，则：168+215+14+15
N=1(2+0.110-0.022
-19182
报告每毫升或每克试样中含产气美膜梭菌数量为1.9×10*CFU/g(mL)或19000CFU/g(mL)。示例2：
只有一个稀释度平板上含少于150个确证为产气英膜梭菌菌落数，如最后一稀释液（10-）经证实含产气英膜梭菌菌落数分别为120和130，则：
120+130
1×2×10
=1250.000
GB/T26425—2010
报告每毫升或每克试样中含产气膜梭菌数量为1.2×10*CFU/g(mL)或1200000CFU/g（mL)。9.2.2经确证后的产气英膜梭菌茵菌数很少的情况下的计算方法与报告9.2.2.1仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含产气英膜梭菌，且均少于15仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含产气荧膜梭菌，且均少于15时，按式（3)计算1mL或1g样品中的产气英膜梭菌数Ne。a
式中：
Ne样品中产气英膜梭菌菌数；
一两个被选择平板中经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和；平板的接种体积，单位为毫升（mL）；d-稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的d值为1)。报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量。示例1：
某固体样品初始悬液的菌落数分别为8和6，则：Ne
1×2×10-1
报告每克试样中含产气英膜梭菌菌数为70CFU/g。14
9.2.2.2液体测试样品原液或其他样品的初始悬液经确证后不含产气英膜梭菌（3)
报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量小于1/d(d为液体测试样品原液或其他样品的初始悬液的稀释因子，未经稀释的液体样品d值为1)。GB/T26425—2010
A.1蛋白陈生理盐水
A.1.1成分
酪蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
1000mL
附录A
（资料性附录）
培养基和试剂
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.0士0.2。A,2亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC)A.2. 1基础培养基
A.2.1.1成分
蛋白陈
大豆蛋白陈
酵母粉
偏重亚硫酸钠(Na,S,O,)
柠檬酸铁铵1
蒸馏水
A.2. 1.2制法
9.0 g~18.0 g2)
1000mL
各成分加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.6士0.2，分装，121℃灭菌15min，5℃士3℃最多可保存2周。
某些情况下（见8.4.2.1)，可能应制备SC琼脂基础培养基平板用于动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基确证试验，因此，将约15mL基础培养基浇注平板（水裕融解后冷却至约44℃～47℃），使之凝固。平板干燥后立即使用。
A.2.2D-环丝氨酸溶液
A.2.2.1成分
D-环丝氨酸?
1）此试剂含铁质量分数应不少于15%2）据凝胶强度而定。
3）仅能使用白色结品粉末。
蒸馏水
A.2.2.2制法
D-环丝氨酸溶于蒸馏水，过滤除菌。3℃士2℃最多可保存4周。A.2.3完全培养基
GB/T26425—2010
临用前，每100mL灭菌的基础培养基（A.2.1)冷却至约44℃～47℃后，加人1mLD-环丝氨酸溶液(A.2.2),立即瓷注平板。
A.2.4SC培养基质量保证和性能测试选择性和生长率试验，见SN/T1538.1-2005。性能测试见SN/T1538.2—2007中的表B.1L见TS(C)]。
A.3液体硫乙醇酸盐培养基
A.3.1成分
酪蛋白陈
L-胱氨酸
D-葡萄糖
酵母粉
氯化钠
硫代乙醇酸钠
刃天青
蒸馏水
A.3.2制法
0.5g~2.0g*
1000mL
加热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.1士0.2，分装每管10mL，121℃高压灭菌15min。使用前需脱气。
A.3.3液体硫乙醇酸盐培养基质量保证和性能测试选择性及生长率测定见SN/T1538.1--2005。性能测试见SN/T1538.22007中的表B.4。A.4乳糖亚硫酸盐(LS)培养基(可选)A.4.1基础培养基
A.4.1.1成分
酪蛋白陈
醇酵母粉
氯化钠
据琼脂凝胶强度面定。
GB/T26425—-2010
L-半胱氨酸盐酸盐
蒸馏水
A.4. 1.2制法
1000mL
溶解各成分（必要时可煮沸溶解）。调整PH值，使培养基pH值在25℃时为7.1士0.2。分装至带有小倒管（Durham小管）的试管中，每管8mL，121℃高压灭菌15min。3℃土2℃最多可保存4周。A.4.2焦亚硫酸钠溶液
A.4.2.1成分
无水焦亚硫酸钠（NazS.O）1.2g蒸馅水
A.4.2.2制法
将焦亚硫酸钠溶于蒸馏水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.3柠檬酸铁铵溶液
A.4.3.1成分
柠檬酸铁铵
蒸馏水
将柠檬酸铁铵溶于蒸馏水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.4完全培养基
培养基若非当天使用，临用前需迅速加热并冷却使之脱气。若培养基装于螺旋盖的瓶中，加热前松开瓶盖，冷却前则拧紧瓶盖。加焦亚硫酸钠溶液（A.4.2)和柠檬酸铁铵溶液（A.4.3)各0.5mL至8mL的基础培养基(A.4.1)中。完全培养基应当天使用。A.5动力硝酸盐培养基（可选）
A.5.1成分
酪蛋白陈
牛肉膏
半乳糖
硝酸钾（KNO.）
磷酸氢二钠（NaHPO）
蒸馏水
5）据琼脂凝胶强度而定。
1. 0 g~5. 0 g5)
1000mL
A.5.2制法
GB/T26425—2010
加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.3士0.2,分装，每管10mL，121℃高压灭菌15min。培养基若非当天使用，于5℃士3℃保存，临用前水浴或蒸汽浴中加热15min后迅速冷却至培养温度使之脱气。5℃士3℃最多可保存4周。A.6硝酸盐还原试剂（可选）
A.6.15-氨基-2-萘磺酸(5-2-ANSA)溶液将5-氨基-2-萘磺酸0.1g溶解于15%（体积分数）的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中（最好具球形滴器），5℃士3℃贮存。A.6.2磺胺酸溶液
将磺胺酸0.4g溶于15%（体积分数）的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中（最好具球形滴器），5℃士3℃贮存。A.6.3完全试剂的用法
临用前等比例混合以上两种溶液（A.6.1及A.6.2)，多余试剂弃去。A.7乳糖-明胶培养基（可选）
A.7.1成分
酪蛋白陈bZxz.net
酵母粉
蒸馏水
A.7.2制法
1000mL
除乳糖和酚红外，溶解其余各成分，调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.5士0.2，加乳糖和酚红，分装，每管10mL，121℃高压灭菌15min。若当天不用，于5℃士3℃保存。过期弃去。临用前，于沸水或流动蒸汽中加热15min，然后迅速冷却至培养温度。5℃士3℃最多可保存3周。9
GB/T26425—2010
附录B
（资料性附录）
本标准与IS07937：2004相比的结构变化情况本标准与ISO7937：2004相比在结构上有较多调整，具体章条编号对照情况见表B.1。表B.1本标准与IS07937：2004的章条编号对照情况本标准章条编号
附录A
A.2.1~A.2. 4
A.3.1~A.3.3
A. 4.1~A 4. 4
A,5.1~A, 5.2
A.6.1~A.6.3
A. 7.1~A. 7. 2
附录B
附录C
对应的国际标准章条编号
5. 2. 1~5. 2. 4
5. 3. 1~5. 3. 3
5.4.1~5.4.4
5.5.1~5,5.2
5.6.1~5.5.3
5.8. 1~5.8.2
附录 A
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