DB13/T 1080-2009
基本信息
标准号： DB13/T 1080-2009
中文名称：乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定
标准类别：地方标准(DB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
DB13/T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定
DB13/T1080-2009
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标准内容
ICS 67.100
河北省地
方标准
DB13/T1080—2009
乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定Delection of β-lactamases in milk and milk products2009-05-27发布Www.bzxZ.net
河北省质量技术蓝馨局
含品伙伴网httn：
2009-06-11实施
http：//foodmate.net前
本标准的附录A和附录℃为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准函河北省质赴技术监督局提出并归口。本标推第一法出河北省食品质量监督检验研究院起草。本标推第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标雅第三法由河北省科学院生物所起草。本标推第一法主要起草人：周正、周巍、李从芬，穆燕魁、张岩。本标第二法主要起草人；李挥、张敬轩、庞坤，范斌、张岩。DB13/T1080-2009
本标准第三法主要起草人：闫静辉、陈英珠，吴萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚璞。http：//foodmate.nethttp：//foodmate.net1范围
浮及乳制品中β一内酰胺酶的测定第一法杯碟法
本标准规定了乳及乳制品中β-内酰胺酶的检验方法-杯碟法。DB13/T 1080--2009
本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中其有活性且对舒巴坦敏感的β-内酰胺酶的检验。本方法的检山限为 4 U/rnL。
2原理
该方法采用对青霖素类药物绝对敏撼的标雅菌株，利用舒巴妞特异性抑制β-内酰胺酶的活性，以青霉素作为指示物，通过比对加人β-内酰胺酶抑制剂与未加人抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的β-内酰胺酶。3设备和材料
抑菌圈测量仪或测量尺。
恒温培养箱：36±1%℃。
高胀灭菌器。
无菌培养l：内径90 mlm，具陶瓦盖。3.5无菌牛津杯：外径（8.0+0.1）mtm，内径（6.0+0.1）mm，高度（10.0±0.1）mm。3.6表氏比浊仪或标推比浊管。
无菌吸管：1 rmL(0.01 mL 刻度值），10 mL(0.1 rL刻度值)。3.8
加样器：5μL～20 μL，20μL～200μL及配套吸头。4培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682中规定的三级水。试验菌种：臻黄微球菌（Mictococcusluteus，CMCc（B）28001），使月菌株代数3-14代。4.1
4.2磷酸盐缓神溶液：按附录 A 中 A.1 规定。4.3生理盐水（8.5 g/L)：按附录A中A.2规定。4.4
青霉素标滩溶液：按附录 A中 A,3 规定。4.59
β-内酰胺酶标溶液：按附录A中A.4规定。4.6
舒巴垣标推溶液按附录A中A.5规定。莺养琼脂培养基：按附录 A 中 A.6 规定。4.7
抗生素检测用培养基I：按附录A中A.7规定。4.9
空白牛奶：按附录A中A,8规定
5操作步骤
5.1菌悬液的制备
将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1°C培养18h~22h，用无菌生埋盐水洗下菌苔即为1
http
DB13/T 10802009
菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×10lCFU/mL，4°C保存，则存期限2周，5.2样品的制备
将待检样品充分混勾，取 1 mL待检样研于 1.5 mL离心管中共 4 管、分别标为：A、B、C、D每个样品做三个平行。
5.3对照的制备
5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶】mL 加人到1.5 mL离心管中共四管，分别标为；A、B、C、D、每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1m加人到1.5mL离心管中，加人β-内酰胺酶标推溶液25L，共做四管，分别标为A、B、C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用-平板的制备
取90mm灭菌培养Ⅲ，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ，凝固后上层加人5ml.含有浓度为 1×10°CFL/mL.藤黄微球菌的抗生素检测用培养基IⅡ，每个检验用平板上均萄置 4个无菌牛津杯。
5.5样品的测定
按照下列顺序分别将青素标准溶液、β-内酰胺酶标雅溶液、舒巴坦标准溶液加入到5,2各离心管中：
青霉素5u。
B舒巴坦25uL、青霉素5μL
Cβ-内酰胺酶25μL（终浓度4 U/mL)、青霉素 5 μL，Dβ-内酰胺酶 25 JL（终浓度 4 I/mL)、舒巴坦 25 μL、青霉素 5 μL。将上述A~I试样混勾后各取200μL加入放置下检验用平板上的4个无菌牛拌杯中，36±1C培养18～22 h，測量抑菌圜直径。取三组卒行试验平均值。6结果观察
各平行试验结果差异应小于2.0mm；阴性对照与研性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。
表1实验现象对应表
性对照
A抑菌爵直径应在20±2.0mm范围内B、D均产生抑菌圈
C 抑菌圈与 D 抑菌图差异人于等下 3.0 mmA 抑菌圈 与 B 抑菌阐差异小于 3.0 mrn7结果报告
B、D均产生抑菌圈
阳性对照
C抑菌网与D抑菌差异大于等于3.0mmA抑菌圈与抑菌圈差异大丁等丁3.0mm7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象：-致可判定检验结果阴性。2
httr
1范围
第二法高效液相色谱一质谱/质谱法DB13/T 1080—2009
本标推规定了乳及乳制品中具有活性的β-内酰胺酶的高效液相色谱-申联质谱的定性检测方法。木标谁适用丁生鲜乳、巴匹杀菌乳及灭菌乳中具有活性的β-内酰胺酶的定性检验。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为4U/mL。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而戏为本标准的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/T6682-2008，IS03696:1987，M0D)。3原理
利用β-内酰胺酶酶解青舞素族药物的原理，在试样中加人一定量氨竺青霉素，酶解后，试样中氮芊肯霉素经乙腈-水溶液提取，提取液浓缩后，用缓冲落液落解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨苄青霉素酶解率，间接定性β-内酰胺酶。4试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为（B/T6682规定的一级水，4.1乙腈：高效液相色谱级。
4.2甲醇：高效液相色谱级。
4.3甲酸：高效液相色谱级。
4.4氯化钠
4.5氢氧化钠。
4.6磷酸二氢钾。
4.7 磷酸氧二钾。
4.80.1rml/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL。4.9乙睛+水（15+2，体积比）。4.10乙腈+水（30+70，体积比）。4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0)：称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL，用氢氧化钠调节 pH 至 7.0±0.1 。4.120.01 rmlol/L乙酸铵溶液（pH=4.5)：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至100) mL，用甲酸调节 pH=4.5±0.1。
4.13氨苄青藓素标准品：纯度大于等于95%。4.14标准储备溶液（100μg/mL）：称取适量标准品（4.14），用超纯水漆解并定容至1000mL，置于=18℃冰箱避光保存；保存期5l。4.15标准工作溶液：吸取适量的氮节青霉素标准储备液（4.15），用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱，或相当者：500mg，6mL，使用前用中醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1 mL水淋洗小柱。3
ht
DB13/T 1080—2009
5仪器
5.1液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS)：配有电喷雾离子源。5.2旋转蒸发器。
5.3固相萃取装置。
5.4低湿冷冻离心机。
5.5均质器。
5.6涡旋混合器。
5.7 plit。
5.8氮吹仪。
6试样制备与保存
敢代衰性样品，混勾后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0～4C冷存放。7分析步骤
7.1氨苄青霉素的加入
称取10样品（精确到0.01g）于50ml.离心管中，加人0.1mL氨苄青霉素标准储备液（4.15)，混勾。7.2酶解
将7.1试样置于37℃恒温水浴，酶解1h。7.3提取
在7.2酶解后的试样中加人20mL乙臂（4.9），均质提取30s，4000rimin低温冷冻离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加人10mL乙睛水溶液（4.9)，洗涤均质器刀头，用玻璃榉捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器头溶液，在涡旋混台器振荡 1 inin，4 000 rfmin 低温冷冻5min，上清腋合并至50mL离心管中，重复用10mL乙水溶液（4.9）洗涤刀头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙情水溶液（4.9）定容至50mL。准确移取25mL于100ml鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37℃水浴）蒸发除去乙，易起沫样品可加入4mL饱和氯化钠溶液。7.4净化
迅速间已除去乙睛的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11），涡旋混匀1min，用0,1mal/l氢氧化钠调5pH为8.5，通过经过预处理的固相获取柱，流逆控制在1ml/rnin，先用2ml,磷酸盐缓浓溶液（4.11）淋洗2次，再用1 mL超纯水淋洗，然后用3mL乙晴洗脱，流速控制在1mL/min。将洗脱液于45℃下氮气吹干，用0.025 ol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至1mL，过0.22 LII滤膜，供LC-MS/MS分析。
7.5测定
7.5.1 参考色谱条件
7.5.1.1色谱柱：00s-C18柱、250 mn1x4.6 mm，粒度5 μm，或相当者。7.5.1.2 流动相：A组为 0.01 1nol/.乙酸铵溶液（甲酸调 pII至4.5);B组为Z。A:B=90:10。7.5.1.3流速：1.0mL/min
7.5.1.4进样量：10 μL。
7.5.2参考质谱条件
7.5.2.1离子源：电喷雾离子源。7.5.2.2扫描方式：正离子扫描。7.5.2.3检测方式：多反应监测（MRM）7.5.2.4毛细管电压：4000 V。
httr
雾化气压力：0.055MPa。
7.5.2.6干燥气流速：10L/min。7.5.2.7离子源温度：350C。
定性离子对、定量离子对等参数见表 1。7.5.2.8
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表 1氨青霉素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和碰撞电压定
氮芋青霉素
ampicillin
7.5.3液相色谱一质谱/质谱测定7.5.3.1定性测定
离子对
350/192
350/160
离子对
350/160
碰撞气
选择氨下青紊的个母离子，2个及以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标谁溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5%之内；样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标谁溶液的色谱图中离子相对度比，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表 2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离了丰度
允许的最大偏差
7.5.3.2定量测定
>20～50
>10～20
用氨芋青霉素标储备溶液配成的基质标雅溶液（4.16）进样分析，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标推工作液行单点校推，外标法计算。7.5.4本底实验
除不加氨苄青霉素外，均按上述操作步骤进行。8 结果计算与表述
8.1试样中氨苄宵霉素含量的计算试样中氨芊肯霉素的含量（g/kg或ug/L)：按式（1）计算A×Cs×V
式中：
X-—试样中芒需素的含迁，单位为微克每于克设微京每升（ugkg或ug/)：人一一试样溶龄中氮卡青垂索的峰面积：AS一一标推工作波中氮芙者垂素的峰面积：CS—标准工作液中筑苯有辑案的浓度，单位为微克年千克或微克每升（μg/kg或gl.)V——试液最终定容体积，单位为毫升(mL)：W——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留3位有效数字。计算结果筛折算回收率。
合批伴网httn
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8.2重复性
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术乎均值的10%。8.3回收率
本方法在试样中添加 0.5 mg/kg~2 mg/kg 浓度时间收率为 80%~110%。9定性判定
氨芒背霉素的酶解率
酶解后试样中氨下青霉素的酶解率（%）：按式（2）计算Y= Co-(C-C)
一酶解后试样中氨苄青密素的酶解率，单位为肖分比（%)：C——-酶解前试样中氮芋霉素的加人浓度，单位为微克每于克或微克每升（μ/kg或μ/L);醒解后试样中氨苯青霉素的含盘，单位为微克每千克或微克每升（ug/kg或ug/L)：一酶解后试样本底中氨苄青素的含壁，单位为微克每干克或微克每升（μug/kg或μL)。9.2结果判定
酶解率=30%，则判定为阴性。
酶解率30%，判定为阴性。
http：
foodmate.net
1范围
第三法碘量法
本标准规定了鲜乳中β-内酰胺酶的快速碘量法检测方法，本标准适用于鲜乳中B-内酰胺酶的测定。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为5U/mL。2规范性引用文件
DB13/T 1080--2009
下列文仆中的条款通过本标推的引用雨成为本标准的条款。凡是注日期的引用文性，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于木标谁，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/T6682-2008，ISO3696:1987，MOD)。3原理
B-内酰胺酶能裂解背霉素的β-内酰胺环形碱背霉噻唑酸，它与淀粉竟争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为白色。如果牛奶中的β-内酰胺酶浓度高于捡测限，检测结果为白色。4试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GR/T6682规定的一级水。4,1可溶性淀粉：按附录 C中C,1规定。4.2碘：按附录 C 中C.2规定
4.3碘化铆：按附录 C 中 C.3 规定。4.4盐酸：按附录C中C.4规定。
4.5青霉素钠；按附录 C 中 C.5规定。4.6B-内酰胺酶对照品：按附录C中C.6规定。4.7不含 β-内酰胺酶的乳品：按附录 C中 C.7规定。5仪器
5.1冷冻干燥机。
5.2恒温干燥箱：40℃。
5.3微量振荡器。
5.4分析天平：精度0.001g。
5.5微波炉。
5.6移液器：10 μL、40 μL、150 μL。5.7冰箱。
5.8微孔板。
6试样制备与保存
取代表性样品，混勾后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0～4℃冷藏短期存放。7对照制备
7.1取阳性对照，用移液器注入500μL水，振荡，充分溶解备用；7.2取朗性对照：用移液器注人500uL水，振荡，充分游解备用；7
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DB13/T 10B0--2009
8测定
根据检测样品数量取适量的检测孔，每孔检测一个样；8.1
8.2取阳性对照150μL加入1个小孔中；8.3 取阴性对照 150 μL 加人 1 个小孔中:8.4样品处理：取奶样，去除悬浮物，用微量移液器吸取奶样150分别加人到检测孔中；8.5所有样品加完后，贴封口膜，置微量振荡器上振荡10分钟；8.6放人40℃恒温箱中，保温20分钟；8.7
取出检溯孔，除去封口膜，用微量移液器吸取1%的淀粉溶液，每孔加人40μL，振荡混匀；8.8用微量移液器吸取碘液，每孔40μL，用移液器吹吸均匀：8.9
振荔2分钟，观察结果。
检测注意事项
混勾要彻底，但不要产生泡沫，严禁将样品溅出。10
结果判定
白色为阳性。
色为阴性。
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本标准的附录A和附录℃为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准函河北省质赴技术监督局提出并归口。本标推第一法出河北省食品质量监督检验研究院起草。本标推第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标雅第三法由河北省科学院生物所起草。本标推第一法主要起草人：周正、周巍、李从芬，穆燕魁、张岩。本标第二法主要起草人；李挥、张敬轩、庞坤，范斌、张岩。DB13/T1080-2009
本标准第三法主要起草人：闫静辉、陈英珠，吴萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚璞。http：//foodmate.nethttp：//foodmate.net1范围
浮及乳制品中β一内酰胺酶的测定第一法杯碟法
本标准规定了乳及乳制品中β-内酰胺酶的检验方法-杯碟法。DB13/T 1080--2009
本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中其有活性且对舒巴坦敏感的β-内酰胺酶的检验。本方法的检山限为 4 U/rnL。
2原理
该方法采用对青霖素类药物绝对敏撼的标雅菌株，利用舒巴妞特异性抑制β-内酰胺酶的活性，以青霉素作为指示物，通过比对加人β-内酰胺酶抑制剂与未加人抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的β-内酰胺酶。3设备和材料
抑菌圈测量仪或测量尺。
恒温培养箱：36±1%℃。
高胀灭菌器。
无菌培养l：内径90 mlm，具陶瓦盖。3.5无菌牛津杯：外径（8.0+0.1）mtm，内径（6.0+0.1）mm，高度（10.0±0.1）mm。3.6表氏比浊仪或标推比浊管。
无菌吸管：1 rmL(0.01 mL 刻度值），10 mL(0.1 rL刻度值)。3.8
加样器：5μL～20 μL，20μL～200μL及配套吸头。4培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682中规定的三级水。试验菌种：臻黄微球菌（Mictococcusluteus，CMCc（B）28001），使月菌株代数3-14代。4.1
4.2磷酸盐缓神溶液：按附录 A 中 A.1 规定。4.3生理盐水（8.5 g/L)：按附录A中A.2规定。4.4
青霉素标滩溶液：按附录 A中 A,3 规定。4.59
β-内酰胺酶标溶液：按附录A中A.4规定。4.6
舒巴垣标推溶液按附录A中A.5规定。莺养琼脂培养基：按附录 A 中 A.6 规定。4.7
抗生素检测用培养基I：按附录A中A.7规定。4.9
空白牛奶：按附录A中A,8规定
5操作步骤
5.1菌悬液的制备
将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1°C培养18h~22h，用无菌生埋盐水洗下菌苔即为1
http
DB13/T 10802009
菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×10lCFU/mL，4°C保存，则存期限2周，5.2样品的制备
将待检样品充分混勾，取 1 mL待检样研于 1.5 mL离心管中共 4 管、分别标为：A、B、C、D每个样品做三个平行。
5.3对照的制备
5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶】mL 加人到1.5 mL离心管中共四管，分别标为；A、B、C、D、每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1m加人到1.5mL离心管中，加人β-内酰胺酶标推溶液25L，共做四管，分别标为A、B、C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用-平板的制备
取90mm灭菌培养Ⅲ，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ，凝固后上层加人5ml.含有浓度为 1×10°CFL/mL.藤黄微球菌的抗生素检测用培养基IⅡ，每个检验用平板上均萄置 4个无菌牛津杯。
5.5样品的测定
按照下列顺序分别将青素标准溶液、β-内酰胺酶标雅溶液、舒巴坦标准溶液加入到5,2各离心管中：
青霉素5u。
B舒巴坦25uL、青霉素5μL
Cβ-内酰胺酶25μL（终浓度4 U/mL)、青霉素 5 μL，Dβ-内酰胺酶 25 JL（终浓度 4 I/mL)、舒巴坦 25 μL、青霉素 5 μL。将上述A~I试样混勾后各取200μL加入放置下检验用平板上的4个无菌牛拌杯中，36±1C培养18～22 h，測量抑菌圜直径。取三组卒行试验平均值。6结果观察
各平行试验结果差异应小于2.0mm；阴性对照与研性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。
表1实验现象对应表
性对照
A抑菌爵直径应在20±2.0mm范围内B、D均产生抑菌圈
C 抑菌圈与 D 抑菌图差异人于等下 3.0 mmA 抑菌圈 与 B 抑菌阐差异小于 3.0 mrn7结果报告
B、D均产生抑菌圈
阳性对照
C抑菌网与D抑菌差异大于等于3.0mmA抑菌圈与抑菌圈差异大丁等丁3.0mm7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象：-致可判定检验结果阴性。2
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1范围
第二法高效液相色谱一质谱/质谱法DB13/T 1080—2009
本标推规定了乳及乳制品中具有活性的β-内酰胺酶的高效液相色谱-申联质谱的定性检测方法。木标谁适用丁生鲜乳、巴匹杀菌乳及灭菌乳中具有活性的β-内酰胺酶的定性检验。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为4U/mL。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而戏为本标准的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/T6682-2008，IS03696:1987，M0D)。3原理
利用β-内酰胺酶酶解青舞素族药物的原理，在试样中加人一定量氨竺青霉素，酶解后，试样中氮芊肯霉素经乙腈-水溶液提取，提取液浓缩后，用缓冲落液落解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨苄青霉素酶解率，间接定性β-内酰胺酶。4试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为（B/T6682规定的一级水，4.1乙腈：高效液相色谱级。
4.2甲醇：高效液相色谱级。
4.3甲酸：高效液相色谱级。
4.4氯化钠
4.5氢氧化钠。
4.6磷酸二氢钾。
4.7 磷酸氧二钾。
4.80.1rml/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL。4.9乙睛+水（15+2，体积比）。4.10乙腈+水（30+70，体积比）。4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0)：称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL，用氢氧化钠调节 pH 至 7.0±0.1 。4.120.01 rmlol/L乙酸铵溶液（pH=4.5)：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至100) mL，用甲酸调节 pH=4.5±0.1。
4.13氨苄青藓素标准品：纯度大于等于95%。4.14标准储备溶液（100μg/mL）：称取适量标准品（4.14），用超纯水漆解并定容至1000mL，置于=18℃冰箱避光保存；保存期5l。4.15标准工作溶液：吸取适量的氮节青霉素标准储备液（4.15），用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱，或相当者：500mg，6mL，使用前用中醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1 mL水淋洗小柱。3
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5仪器
5.1液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS)：配有电喷雾离子源。5.2旋转蒸发器。
5.3固相萃取装置。
5.4低湿冷冻离心机。
5.5均质器。
5.6涡旋混合器。
5.7 plit。
5.8氮吹仪。
6试样制备与保存
敢代衰性样品，混勾后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0～4C冷存放。7分析步骤
7.1氨苄青霉素的加入
称取10样品（精确到0.01g）于50ml.离心管中，加人0.1mL氨苄青霉素标准储备液（4.15)，混勾。7.2酶解
将7.1试样置于37℃恒温水浴，酶解1h。7.3提取
在7.2酶解后的试样中加人20mL乙臂（4.9），均质提取30s，4000rimin低温冷冻离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加人10mL乙睛水溶液（4.9)，洗涤均质器刀头，用玻璃榉捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器头溶液，在涡旋混台器振荡 1 inin，4 000 rfmin 低温冷冻5min，上清腋合并至50mL离心管中，重复用10mL乙水溶液（4.9）洗涤刀头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙情水溶液（4.9）定容至50mL。准确移取25mL于100ml鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37℃水浴）蒸发除去乙，易起沫样品可加入4mL饱和氯化钠溶液。7.4净化
迅速间已除去乙睛的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11），涡旋混匀1min，用0,1mal/l氢氧化钠调5pH为8.5，通过经过预处理的固相获取柱，流逆控制在1ml/rnin，先用2ml,磷酸盐缓浓溶液（4.11）淋洗2次，再用1 mL超纯水淋洗，然后用3mL乙晴洗脱，流速控制在1mL/min。将洗脱液于45℃下氮气吹干，用0.025 ol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至1mL，过0.22 LII滤膜，供LC-MS/MS分析。
7.5测定
7.5.1 参考色谱条件
7.5.1.1色谱柱：00s-C18柱、250 mn1x4.6 mm，粒度5 μm，或相当者。7.5.1.2 流动相：A组为 0.01 1nol/.乙酸铵溶液（甲酸调 pII至4.5);B组为Z。A:B=90:10。7.5.1.3流速：1.0mL/min
7.5.1.4进样量：10 μL。
7.5.2参考质谱条件
7.5.2.1离子源：电喷雾离子源。7.5.2.2扫描方式：正离子扫描。7.5.2.3检测方式：多反应监测（MRM）7.5.2.4毛细管电压：4000 V。
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雾化气压力：0.055MPa。
7.5.2.6干燥气流速：10L/min。7.5.2.7离子源温度：350C。
定性离子对、定量离子对等参数见表 1。7.5.2.8
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表 1氨青霉素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和碰撞电压定
氮芋青霉素
ampicillin
7.5.3液相色谱一质谱/质谱测定7.5.3.1定性测定
离子对
350/192
350/160
离子对
350/160
碰撞气
选择氨下青紊的个母离子，2个及以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标谁溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5%之内；样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标谁溶液的色谱图中离子相对度比，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表 2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离了丰度
允许的最大偏差
7.5.3.2定量测定
>20～50
>10～20
用氨芋青霉素标储备溶液配成的基质标雅溶液（4.16）进样分析，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标推工作液行单点校推，外标法计算。7.5.4本底实验
除不加氨苄青霉素外，均按上述操作步骤进行。8 结果计算与表述
8.1试样中氨苄宵霉素含量的计算试样中氨芊肯霉素的含量（g/kg或ug/L)：按式（1）计算A×Cs×V
式中：
X-—试样中芒需素的含迁，单位为微克每于克设微京每升（ugkg或ug/)：人一一试样溶龄中氮卡青垂索的峰面积：AS一一标推工作波中氮芙者垂素的峰面积：CS—标准工作液中筑苯有辑案的浓度，单位为微克年千克或微克每升（μg/kg或gl.)V——试液最终定容体积，单位为毫升(mL)：W——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留3位有效数字。计算结果筛折算回收率。
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8.2重复性
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术乎均值的10%。8.3回收率
本方法在试样中添加 0.5 mg/kg~2 mg/kg 浓度时间收率为 80%~110%。9定性判定
氨芒背霉素的酶解率
酶解后试样中氨下青霉素的酶解率（%）：按式（2）计算Y= Co-(C-C)
一酶解后试样中氨苄青密素的酶解率，单位为肖分比（%)：C——-酶解前试样中氮芋霉素的加人浓度，单位为微克每于克或微克每升（μ/kg或μ/L);醒解后试样中氨苯青霉素的含盘，单位为微克每千克或微克每升（ug/kg或ug/L)：一酶解后试样本底中氨苄青素的含壁，单位为微克每干克或微克每升（μug/kg或μL)。9.2结果判定
酶解率=30%，则判定为阴性。
酶解率30%，判定为阴性。
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foodmate.net
1范围
第三法碘量法
本标准规定了鲜乳中β-内酰胺酶的快速碘量法检测方法，本标准适用于鲜乳中B-内酰胺酶的测定。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为5U/mL。2规范性引用文件
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下列文仆中的条款通过本标推的引用雨成为本标准的条款。凡是注日期的引用文性，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于木标谁，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（GB/T6682-2008，ISO3696:1987，MOD)。3原理
B-内酰胺酶能裂解背霉素的β-内酰胺环形碱背霉噻唑酸，它与淀粉竟争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为白色。如果牛奶中的β-内酰胺酶浓度高于捡测限，检测结果为白色。4试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GR/T6682规定的一级水。4,1可溶性淀粉：按附录 C中C,1规定。4.2碘：按附录 C 中C.2规定
4.3碘化铆：按附录 C 中 C.3 规定。4.4盐酸：按附录C中C.4规定。
4.5青霉素钠；按附录 C 中 C.5规定。4.6B-内酰胺酶对照品：按附录C中C.6规定。4.7不含 β-内酰胺酶的乳品：按附录 C中 C.7规定。5仪器
5.1冷冻干燥机。
5.2恒温干燥箱：40℃。
5.3微量振荡器。
5.4分析天平：精度0.001g。
5.5微波炉。
5.6移液器：10 μL、40 μL、150 μL。5.7冰箱。
5.8微孔板。
6试样制备与保存
取代表性样品，混勾后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0～4℃冷藏短期存放。7对照制备
7.1取阳性对照，用移液器注入500μL水，振荡，充分溶解备用；7.2取朗性对照：用移液器注人500uL水，振荡，充分游解备用；7
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8测定
根据检测样品数量取适量的检测孔，每孔检测一个样；8.1
8.2取阳性对照150μL加入1个小孔中；8.3 取阴性对照 150 μL 加人 1 个小孔中:8.4样品处理：取奶样，去除悬浮物，用微量移液器吸取奶样150分别加人到检测孔中；8.5所有样品加完后，贴封口膜，置微量振荡器上振荡10分钟；8.6放人40℃恒温箱中，保温20分钟；8.7
取出检溯孔，除去封口膜，用微量移液器吸取1%的淀粉溶液，每孔加人40μL，振荡混匀；8.8用微量移液器吸取碘液，每孔40μL，用移液器吹吸均匀：8.9
振荔2分钟，观察结果。
检测注意事项
混勾要彻底，但不要产生泡沫，严禁将样品溅出。10
结果判定
白色为阳性。
色为阴性。
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